バイオマーカー

专利摘要:
本発明は、結合剤およびグレリンシグナルペプチドについてのアッセイを提供する。これらの剤およびアッセイは、対象における急性心障害、グルコース処理障害、および糖尿病を予測する、診断する、評価する、またはモニターするための方法において有用である。本発明の方法において有用なヌクレオチド、ポリペプチド、およびキットもまた提供される。本発明はまた、対象におけるグルコース処理を評価するための方法であって、（ａ）グルコースの投与の後に、対象におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを測定する工程および（ｂ）上述のＧＲＮ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰと比較する工程を含み、コントロールレベルからのＧＲＮ−ＳＰの測定レベルにおける偏差は、グルコース処理障害を示す方法をも提供する。
公开号:JP2011516038A
申请号:JP2010550628
申请日:2009-03-12
公开日:2011-05-26
发明作者:マイケル；ゲイリー ニコールズ，；クリストファー；ジョセフ ペンバートン，；ティモシー；グラント ヤンデル，；アーサー；マーク リチャーズ，
申请人:オタゴ イノベーション リミテッド；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 本発明は、グレリンシグナルペプチド（ＧＲＮ−ＳＰ）ならびに血行路へのマーカーの放出をもたらす生物学的事象または障害または状態の予後、診断、およびモニタリングにおけるその使用に関する。そのような状態は、肥満症ならびにグルコース処理障害（glucose handling disorder）、糖尿病、および心血管疾患、特に急性心障害などの関連する状態を含む。]
背景技術

[0002] 肥満症は、ヒト集団において多発している。それは、西洋の世界における予防可能な死亡の主要な原因のうちの１つである。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）は、上位１０の世界的な健康問題のうちの１つとして肥満症を認識している。]
[0003] 集団における肥満症の原因は、様々な遺伝要因および社会的要因に帰することができる。しかし、根本的なレベルでは、肥満症は、エネルギー摂取がエネルギー消費を超える場合に生じる。肥満の個人は、糖尿病および心血管疾患、特に急性心障害などの関連する状態を発病する危険性がある。]
[0004] 真性糖尿病（Diabetes Mellits）は、インスリン分泌、インスリン作用、またはその両方における欠乏によって特徴づけられる代謝障害である。これらの欠乏は、慢性高血糖症をもたらす。糖尿病は、世界的に、１億７０００万人以上の人々を冒し、次の２０年間で２倍になることが予想される。]
[0005] 糖尿病は、１型糖尿病および２型糖尿病として公知の２つの型に分類される。１型糖尿病は、個人の免疫系が膵臓のベータ細胞を破壊するように作用する自己免疫関連障害である。１型糖尿病を有する個人は、一般的に、インスリン依存性である。彼らは、たとえあったとしても、限られたインスリン分泌を呈する。]
[0006] ２型糖尿病は、症例の９０〜９５％を占める、最も一般的な形態である。大多数の２型糖尿病患者は、インスリン依存性ではないが、インスリン分泌およびインスリン作用の欠乏を呈し、高血糖症に至る。高血糖症は、多くの場合、軽度であり、認識することが困難な症状を有する。その結果として、多くの２型糖尿病患者が、長年の間、診断未確定になる。いつでも、人口の１５〜２０％は、２型糖尿病を発病する危険性がある可能性があるが、診断未確定であると推定されている。]
[0007] 糖尿病は、グルコース処理を評価する経口グルコース負荷試験に基づいて最も一般的に診断される。個人は、グルコースに対する耐性を試験するために、一晩の絶食の後にグルコース飲料が与えられる。試験は、応答を測定するのに数時間かかる。あいにく、グルコース負荷試験および空腹時インスリンレベル試験は、糖尿病の予後の指標としてのそれらの有用性を制限する、感度の不足および偽陽性の問題がある。]
[0008] 肥満はまた、心性の事象の危険性を２〜３倍増加させる、心血管疾患に対する重要な危険因子である。糖尿病、または前兆グルコース処理障害（precursor glucose handling disorder）、および心血管疾患などの関連する状態を発病する個人の危険性を評価するための診断ツールおよび予後ツールに対して必要性が認識されているにもかかわらず、簡単で正確な試験は、入手可能ではない。]
[0009] 糖尿病および前兆グルコース処理障害または異常血糖（ｄｙｓｇｌｙｃｅｍｉａ）もしくは異常インスリン血症（dysinsulinemia）の任意の他の形態の早期診断および継続評価は、その糖尿病の管理だけではなく、心血管疾患などの関連する状態の管理にとっても重要である。異常血糖または異常インスリン血症と関連する状態および障害、疾患のための早期検出法の提供に加えて、たとえば、本発明はまた、心血管エリアにおけるより広範な適用を有する。]
[0010] 急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を含む急性心障害は、不安定狭心症から急性心筋梗塞（ＡＭＩ）まで及ぶ、広い範囲の心性虚血性事象を包含する。ＡＭＩはこれらの事象のうちで最も重篤なものとして現れ、そのため、迅速で正確な診断を必要とする。２つまたはそれを超える記載される特徴（虚血性の胸部不快感の病歴、連続心電図（ＥＣＧ）トレース上の漸進的変化、ならびに血漿心性バイオマーカーの上昇および低下）の症状を示す患者は、ＡＭＩを被っているとして明らかに同定される２６。しかしながら、疑わしいＡＭＩの症状を示す、かなりの割合の患者（４０％〜５０％）は、ＥＣＧ上の連続変化または典型的な症状を有しておらず、したがって、正確な診断のために、循環バイオマーカー濃度に関し大きな重点が置かれる２６、２７。]
[0011] 心筋梗塞の正確な早期診断は、有効な経皮的血管再生または血栓溶解血管再生ならびに付属的な抗凝固療法および抗血小板療法を含む再灌流治療の即時の導入を容易にする。そのような治療は、診断および管理におけるそれぞれの時間遅延を伴い、死亡率および罹患率を低下させるのに、漸進的に有効性が低下する２〜４。この臨床的状況における意思決定の加速に対する必要性を考慮すれば、たとえば急性心障害、特にＡＭＩの早期で、特異的な診断を提供する循環バイオマーカーの同定に対する必要性がある。]
[0012] 実際に、現在の臨床ガイドラインは、心筋梗塞および急性冠動脈症候群の同定において、バイオマーカー測定の重要性を強調する２６。クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、トロポニンＴ（ＴｎＴ）、トロポニンＩ（ＴｎＩ）ＢＮＰ、Ｎ−ＢＮＰ（ＮＰ−ＢＮＰとしても公知）、ＢＮＰシグナルペプチド（ＢＮＰ−ＳＰ）、およびミオグロビンを含む多くのバイオマーカーは、この目的のために提案されてきたが、それらの使用に限界がある。血漿心性バイオマーカーの検出可能なまたは異常な上昇に対する時間は、６時間まで（ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ）〜１２時間（ＴｎＴ、ＴｎＩ、ＢＮＰ、Ｎ−ＢＮＰ）であり得、ピークレベルは、傷害の発症の２４〜４８時間後まで生じず、的確な診断および治療に際して、時間の遅延を課す１〜４。さらに、ミオグロビンおよびＣＫ−ＭＢの両方は、非特異的であり、とりわけ外傷または外科手術の間に、心外性の源から分泌され得る１。]
[0013] そのため、公知のマーカーの長期診断／予測能力は、臨床提示の最初の数時間以内の、急性心外傷などの急性心障害の早期の特異的な診断を提供する、特異的マーカーが伴う能力を欠く。早期マーカーに対するその必要性は、なお存在する。]
[0014] 本発明のさらなる目的は、急性心障害の早期マーカーを提供することおよび／または有用な選択肢を公衆に少なくとも提供することである。]
課題を解決するための手段

[0015] ヒトグレリンシグナルペプチド（ＧＲＮ−ＳＰ）は、グレリン（プレプログレリン）（１〜１１７）配列番号１から切断される２３アミノ酸ペプチドである。ヒトプレプログレリンのプロセシングを図５に示す。ＧＲＮ−ＳＰ（１〜２３）を、配列番号１５に単独で示す。] 図５
[0016] 出願人らは、グレリンシグナルペプチドＧＲＮ−ＳＰおよびその断片が血行路へ放出されることを初めて発見した。有用な循環バイオマーカーが、同定され、提供される。以前は、ＧＲＮ−ＳＰは、細胞内でしか生産されないと考えられていた２５。]
[0017] この発見に基づいて、出願人らは、本発明の一態様において、対象における生物学的事象または障害を予測する、診断する、評価する、またはモニターするための方法であって、事象は、血行路への、１つまたは複数のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの放出と相互に関連し、対象から採取されるまたは対象に由来する試料における１つまたは複数のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および上記レベルを、上述の１つまたは複数のバイオマーカーについてのそれぞれの対照標準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）または範囲と関連して分析する工程を含む方法を提供する。]
[0018] 一実施形態において、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーは、ＧＲＮ−ＳＰである。他の実施形態において、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーは、ＧＲＮ−ＳＰ断片である。好ましい一実施形態において、ＧＲＮ−ＳＰ断片は、ヒトＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）（配列番号１７）である。]
[0019] 他の実施形態において、本方法は、対象から採取されるまたは対象に由来する１つまたは複数の試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルと比較する工程を含み、該コントロールレベルからの、該測定レベルにおける偏差は、生物学的事象または障害を示す。]
[0020] １型糖尿病対象などの糖尿病対象においてまたはグレリン分泌レベルの低下に起因する他の異常血糖を有する対象において、グレリンのレベルは、ＧＲＮ−ＳＰレベルおよび／またはＧＲＮ−ＳＰ断片レベルのように、正常とは異なるであろう。この発見は、ＧＲＮ−ＳＰが、そのような状態に対するマーカーとして有用であることを示す。対象のインスリン状態に依存して、対象におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルは、正常よりも高いまたは低いであろう。]
[0021] ２型糖尿病対象などの糖尿病対象においてまたは他の異常インスリン血症を有する対象において、グレリンのレベルは、ＧＲＮ−ＳＰレベルおよび／またはＧＲＮ−ＳＰ断片レベルのように、正常より高くなるであろう。この発見は、ＧＲＮ−ＳＰおよび／またはＧＲＮ−ＳＰ断片が、そのような状態に対するおよびメタボリックシンドロームなどの他の高インスリン血症状態におけるマーカーとして有用であることを示す。対象のインスリン状態に依存して、対象におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルは、正常よりも高いまたは低いであろう。]
[0022] したがって、他の態様において、本発明は、糖尿病または糖尿病の可能性ならびに異常血糖および／または異常インスリン血症によって特徴づけられる他の状態を予測する、診断する、評価する、またはモニターするための方法であって、対象から採取されるまたは対象に由来する試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および上記レベルを、上述の１つまたは複数のバイオマーカーについてのそれぞれの対照標準値と関連して分析する工程を含む方法を提供する。]
[0023] 他の実施形態において、本方法は、対象から採取されるまたは対象に由来する１つまたは複数の試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルから外れるＧＲＮ−ＳＰの測定レベルは、糖尿病もしくは糖尿病に対する素因、または異常血糖および／もしくは異常インスリン血症と関連する他の状態を示す。一実施形態において、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルは、コントロールよりも低くてもよい。]
[0024] 本発明はまた、対象におけるグルコース処理を評価するための方法であって、
（ａ）グルコースの投与の後に、対象におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを測定する工程および
（ｂ）上述のＧＲＮ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰと比較する工程を含み、
コントロールレベルからのＧＲＮ−ＳＰの測定レベルにおける偏差は、グルコース処理障害を示す方法をも提供する。]
[0025] 出願人らは、驚いたことに、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの循環濃度が、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の疑いの発症後の最初の数時間においてまたは疑わしい急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の臨床提示のときに最も高いことを発見した。ピークは、これらの最初の時間において、正常コントロール集団よりも、例えば、１．５〜５倍高い、一般的には２〜３倍。]
[0026] したがって、さらなる態様において、本発明は、対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロールまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲からのＧＲＮ−ＳＰおよび／またはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは所定の対照標準値もしくは対照標準値の範囲よりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法を提供する。]
[0027] 本発明はまた、対象における、生物学的事象もしくは障害、特に急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答をモニターするための方法であって、対象から採取されるまたは対象に由来する生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロールまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは所定の対照標準値もしくは対照標準値の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルにおける変化は、治療に対する応答を示す方法をも提供する。]
[0028] 他の態様において、本発明はまた、対象における心臓移植拒絶エピソードを予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、心臓移植の後に、対象から採取されるまたは対象に由来する試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロールまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲よりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、移植拒絶または移植拒絶エピソードを示す方法をも提供する。]
[0029] 本発明はまた、対象における肺障害および急性心障害（ＡＣＤ）を区別するための方法であって、対象から採取されるまたは対象に由来する試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロールまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲よりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法をも提供する。]
[0030] 本発明はまた、対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の約６もしくは４時間以内に、対象から採取されるまたは対象に由来する試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、好ましくはＧＲＮ−ＳＰ断片のレベルを測定する工程およびＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルを、コントロールまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準値もしくは対照標準値の範囲よりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、ＡＣＤまたは心臓移植拒絶を示す方法をも提供する。]
[0031] より広範な実施形態において、出願人らの発見は、ＧＲＮ−ＳＰまたはＧＲＮ−ＳＰ断片が血行路へ放出される任意の事象を予測する、診断する、評価する、またはモニターするために使用することができる。]
[0032] 本発明の心性の方法の一実施形態において、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルは、障害の提示またはその発生（ｏｃｃｕｒａｎｃｅ）の約６時間、もしくは約４時間、もしくは約２時間、もしくは約１時間、約３０分以内に、または約１５分以内に、対象から採取される試料（または試料誘導体）において１回または複数回測定される。６時間、４時間、２時間、１時間、２分の１時間、および４分の１時間以内の１回または複数回のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー測定は、本発明に含まれる。６時間後に、対象から引き続いて採取されるまたは対象に由来する試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー測定またはさらなるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー測定もまた含まれる。]
[0033] 一実施形態において、本発明の方法は、インビトロ方法である。]
[0034] 一実施形態において、生物学的試料は、血液、唾液、間質液、血漿、尿、血清、または心臓組織である。好ましい一実施形態において、試料は、血液または血漿である。]
[0035] 一実施形態において、測定工程は、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーおよびＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーに選択的に結合する結合剤の間の結合を検出する工程を含む。一実施形態における測定工程は、
（ａ）ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーを結合剤と結合させる工程および
（ｂ）結合したＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程を含む。]
[0036] 一実施形態における結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である。最も一般的に、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。]
[0037] 他の実施形態において、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルは、質量分析（mass spectroscopy）を使用して測定される。]
[0038] 抗体が結合するまたは抗体によって検出されるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーは、完全長ヒトＧＲＮ−ＳＰ分子（配列番号１５）またはその抗原性変異体もしくは抗原性断片である。一実施形態において、断片は、長さが少なくとも４つの隣接するアミノ酸である。他の実施形態において、結合するまたは検出される断片は、ヒトＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）配列番号１７である。抗体は、ＧＲＮ−ＳＰまたはＧＲＮ−ＳＰ断片のＮ末端またはＣ末端に結合し得る。]
[0039] 結合剤が選択的に結合する特異的な抗原性ペプチドは、ヒトＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）（配列番号１７）、またはその抗原性結合断片もしくは抗原性結合変異体を含む。]
[0040] 一実施形態におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの結合は、固相上に固定される抗体または抗体断片を使用して測定される。]
[0041] ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定、免疫蛍光アッセイ、マススペクトロメトリー（mass spectrometry）、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを用いて有用に測定されてもよい。]
[0042] したがって、本発明はまた、対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、試料または試料誘導体におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイをも提供する。]
[0043] 本発明はまた、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーについてのアッセイであって、
（ａ）試料からの１つまたは複数のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーを結合させる工程および
（ｂ）結合したＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程を含むアッセイをも提供する。]
[0044] ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーは、本発明のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー結合剤を使用して結合させてもよい。]
[0045] 本発明はまた、対象における生物学的事象または障害を予測する、診断する、評価する、またはモニターするのに使用されるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーアッセイを提供する。]
[0046] 一実施形態において、アッセイは、インビトロアッセイである。]
[0047] 本発明の異常血糖関連方法は、たとえば糖尿病の１つまたは複数の非ＧＲＮ−ＳＰ／ＧＲＮ−ＳＰ断片マーカーのレベルを測定する工程およびそれらのレベルを、コントロールからのマーカーレベルと比較する工程をさらに含んでいてもよく、非ＧＲＮ−ＳＰマーカーのコントロールレベルからの測定レベルにおける偏差は、ＧＲＮ−ＳＰのコントロールレベルから外れるまたはそれよりも低いＧＲＮ−ＳＰの測定レベルと共に、たとえば糖尿病を予測するもしくは診断するのに役立つかまたはたとえば、糖尿病をモニターするために使用することができる。]
[0048] 糖尿病についての非ＩＮＳ−ＳＰ／ＩＮＳ−ＳＰ断片マーカーは、グルコース、インスリン、ラクテート、およびトリグリセリドもしくは脂肪酸のレベルを含んでいてもよい。他のマーカーは、ＨｂＡ１Ｃおよびフルクトサミン（fructoseamine）を含む。]
[0049] 本発明の心性関連方法は、上述のＡＣＤまたは心臓移植拒絶またはＡＣＤ／肺障害の１つまたは複数の非ＧＲＮ−ＳＰマーカーまたは非ＧＲＮ−ＳＰ断片マーカーのレベルを測定する工程およびそれらのレベルを、コントロールまたは対照標準値または対照標準値の範囲からのマーカーレベルと比較する工程をさらに含んでいてもよく、非ＧＲＮ−ＳＰマーカーのコントロールレベルまたは対照標準レベルからのその測定レベルにおける偏差は、コントロールまたは対照標準ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルよりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルと共に、ＡＣＤを予測するもしくは診断するのに役立つかまたは上述のＡＣＤ（心臓移植拒絶を含む）またはＡＣＤ／肺障害を評価するまたはモニターするために使用することができる。]
[0050] 急性冠動脈症候群との関連において使用されるマーカーは、トロポニン、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＢＮＰ−ＳＰ断片、ＡＮＰ、ＡＮＰ−ＳＰ、ＡＮＰ−ＳＰ断片、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、心臓特異的脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、虚血修飾アルブミン、エンドセリン、アドレノメデュリン、およびアンギオテンシンＩＩを含む。]
[0051] 他の態様において、本発明はまた、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー結合剤をも提供する。一実施形態において、本発明のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー結合剤は、
（ａ）ＧＲＮ−ＳＰ（１〜２３）配列番号１５、
（ｂ）ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）配列番号１７、
（ｃ）配列番号１６もしくは配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの変異体もしくは断片
に結合するまたはそれを検出する。]
[0052] 結合剤は、血行路へのＧＲＮ−ＳＰまたはＧＲＮ−ＳＰの断片の放出と相互に関連する生物学的事象または障害を予測する、診断する、評価する、またはモニターするのに有用である。そのような事象または障害は、対象における糖尿病、グルコース処理障害、および急性心障害（ＡＣＤ）を含む。]
[0053] 一実施形態において、結合剤は、抗ＧＲＮ−ＳＰ抗体もしくは抗ＧＲＮ−ＳＰ断片抗体またはいずれかの抗原結合断片である。]
[0054] 本発明はまた、
（ａ）ＧＲＮ−ＳＰアミノ酸配列１〜２３（配列番号１５）、
（ｂ）ＧＲＮ−ＳＰ アミノ酸配列１〜９（配列番号１７）、
（ｃ）配列番号１６もしくは配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
（ｄ）（ａ）または（ｃ）の変異体もしくは断片
に結合する抗ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー抗体またはその抗原結合断片をも提供する。]
[0055] 抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはいずれかの結合断片もしくは構築物であってもよい。]
[0056] 本発明はまた、対象における生物学的事象もしくは障害を評価するためのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーアッセイの製造における、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー結合剤の使用または対象における生物学的事象もしくは障害に対する予後ツール、評価ツール、診断ツール、もしくはモニターツールの製造における、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー結合剤の使用をも目的とする。一実施形態において、上記事象または障害は、グルコース処理障害、糖尿病、または急性心障害（ＡＣＤ）によるものを含めた、血行路へのＧＲＮ−ＳＰおよび／またはＧＲＮ−ＳＰ断片の放出と相互に関連する。]
[0057] 本発明はまた、対象におけるグルコース処理障害、糖尿病、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を含む、血行路へのＧＲＮ−ＳＰおよび／またはＧＲＮ−ＳＰ断片の放出と相互に関連する生物学的事象もしくは障害を評価するための予後ツール、診断ツール、評価ツール、またはモニターツールの製造における、本発明の抗体または抗原結合断片の使用にも関する。]
[0058] 一実施形態において、予後ツール、診断ツール、またはモニターツールは、約０．１〜約５００ｐｍｏｌ／Ｌ、約１〜約３００ｐｍｏｌ／Ｌ、約１０〜約２５０ｐｍｏｌ／Ｌまたは約２０〜約１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＧＲＮ−ＳＰレベルを測定するために較正される。]
[0059] 他の態様において、本発明は、対象における生物学的事象もしくは障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、本発明のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー結合剤を含むキットを提供する。]
[0060] 一実施形態において、キットは、約０．１〜約５００ｐｍｏｌ／Ｌ、約１〜約３００ｐｍｏｌ／Ｌ、約１０〜約２５０ｐｍｏｌ／Ｌまたは約２０〜約１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルを測定するために較正される。]
[0061] 一実施形態において、キットはまた、試料または試料の派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）において測定されるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルから、対象におけるグルコース処理障害、たとえば糖尿病またはＡＣＤを含む生物学的事象または障害を予測し、診断し、評価し、またはモニターし、かつ測定レベルをコントロールレベルまたは対照標準レベルと比較するための説明書をも含む。コントロールレベルまたは対照標準レベルから外れる測定ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルは、たとえばＡＣＤ（移植拒絶を含む）、グルコース処理障害、または糖尿病などの生物学的事象または障害を示す。一実施形態において、試料は、発症または臨床提示の４時間以内に得られる。]
[0062] 他の態様において、本発明は、ＧＲＮ−ＳＰ断片をコードする核酸分子であって、上述の核酸は、
（ａ）配列番号１８またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、
（ｃ）配列番号１８またはその変異体もしくは断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体から、配列が配列番号１６ではないということを条件として、選択される核酸分子に関する。]
[0063] 一実施形態において、核酸分子によってコードされるＧＲＮ−ＳＰ断片は、ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）配列番号１７である。]
[0064] 本発明はまた、本発明の核酸分子を含む遺伝子構築物を提供する。一実施形態において、遺伝子構築物は、発現構築物である。遺伝子構築物を含むベクター、遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチド、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、および本発明のポリペプチドを組換えで生産するための方法もまた本発明によって提供される。]
[0065] したがって、他の態様において、本発明は、
（ａ）ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）（配列番号１７）またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１７のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および
（ｃ）本発明の核酸分子によってコードされるＧＲＮ−ＳＰポリペプチドから選択される単離ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーまたはその変異体もしくは断片を提供する。]
[0066] 本発明はまた、抗ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー抗体の調製における本発明のポリペプチドの使用に関する。]
[0067] 本発明のポリペプチドを組換えで生産するための１つの方法は、
（ａ）本発明のポリペプチドを発現することができる本発明の遺伝子構築物を含む宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を選択する工程、
（ｃ）細胞から発現ポリペプチドを分離する工程、および任意選択で
（ｄ）発現ポリペプチドを精製する工程を含む。]
[0068] 一実施形態において、本方法は、構築物を用いて宿主細胞をトランスフェクトするためのプレ工程を含む。]
[0069] 本発明は、ここでは、添付図面における図に関連して記載される。]
図面の簡単な説明

[0070] 図１Ａは、患者における循環ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）バイオマーカー濃度が、心性の源に由来することを示す棒グラフである。図１Ｂは、循環成熟グレリンが心臓によって除去されること示す棒グラフである。
図２は、健康なヒトにおけるＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）バイオマーカーの血漿濃度が、ＢＭＩとの相互関係を示さないことを実証するラジオイムノアッセイの結果を示す図である。
図３は、血液におけるグレリン−ＳＰｎ（１〜９）免疫反応性が正常で健康な個人における肥満度指数との相互関係を示さないことを実証するラジオイムノアッセイの結果を示す図である。
図４は、免疫反応性血漿グレリン−ＳＰｎ（１〜９）が、グレリン自体のように、代謝的負荷下でのインスリン感度および放出についての一般的な試験である７５ｇのグルコースの経口摂取によって、有意に低下することを実証するラジオイムノアッセイの結果を示す図である。
図５は、遊離シグナル、Ｎ−グレリン、およびグレリンペプチドの生成をもたらす、ヒトプレプログレリンのプロセシングを概説する概略図である。
図６は、ラジオイムノアッセイ結果を示す図である。上パネル：病院救急科での提示の時間（ｔ＝０）からの、立証されたＳＴ上昇心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）を有する患者におけるＧＨＲ−ＳＰｎ（１〜９）バイオマーカーの連続的な血漿濃度。ＧＨＲ−ＳＰｎが、提示の約１〜２時間後にピークレベルに達し、８〜１２時間までに正常なレベルまで戻ったことに注目されたい。正常範囲データは、正常範囲の上位および下位の百分位数を示す赤色の線によって示される。下パネル：上パネルにおいて同定された同じＳＴＥＭＩ患者における、同時のＴｎＩ、ＣＫ−ＭＢ、およびミオグロビン血漿レベル。
図７は、ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）バイオマーカー抗血清の交差反応性データの表である。
図８は、それぞれ、ラット、ヒト、ヒツジ、ブタ、マウス、イヌ、およびネコからのグレリンシグナルペプチド配列についてのコンセンサスアライメントを示す図である。] 図１Ａ 図１Ｂ 図２ 図３ 図４ 図５ 図６ 図７ 図８
[0071] 定義
急性心障害（ＡＣＤ）は、提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴う急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を含む急性冠動脈症候群、不安定狭心症、および急性非ＳＴ上昇心筋梗塞；心虚血；急性心外傷；急性薬物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、および心臓移植拒絶を含むが、これらに限定されない。これらの障害の十分な説明的な定義は、参考文献１において見つけられる。]
[0072] ＡＣＤ／肺障害は、診断未確定のまたは疑わしいＡＣＤまたは肺障害を有する対象を指す。]
[0073] 急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）は、不安定狭心症、主要心電図（ＥＣＧ）上でのＳＴ上昇を伴う急性心筋梗塞、およびＥＣＧ上でのＳＴセグメント上昇を伴わない急性心筋梗塞を含む広い範囲の心虚血事象を包含する。]
[0074] 用語「抗体」は、抗体を合成するために使用される抗原を含む分子と特異的に相互作用する（結合する）かまたはそれと密接に関係する抗原と特異的に相互作用する（結合する）特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。本明細書において使用されるように、用語「抗体」は、完全長抗体を広く含み、そのある種の抗体断片を含んでいてもよい。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、多価抗体および一価抗体、多特異的抗体（たとえば二特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに親和性成熟した抗体もまた含まれる。抗体が、ＧＲＮ−ＳＰに優先的に結合する、たとえば、非ＧＲＮ−ＳＰポリペプチドと２５％未満または１０％未満または１％未満または０．１％未満の交差反応性を有する場合、抗体は、本発明のＧＲＮ−ＳＰポリペプチドに選択的にまたは特異的に結合する。通常、抗体は、抗原またはエピトープに対して、１０−６もしくは１０−７Ｍ以下のまたは約１０−８Ｍもしくは１０−９Ｍもしくは１０−１０もしくは１０−１１もしくは１０−１２Ｍ未満の結合親和性（解離定数（Ｋｄ）値）を有する。結合親和性は、たとえば表面プラズマ共鳴またはスキャッチャード分析を使用して評価されてもよい。]
[0075] 本明細書において使用されるように、「抗原結合断片」または「抗体断片」は、好ましくは、その抗体断片の正常な機能のほとんどもしくはすべて、または最小ではその抗体断片の正常な機能の少なくとも１つを保持する、完全な抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の部分を意味する。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ダイアボディ、一本鎖抗体（ＳｃＦＶ）、ならびに多特異的抗体を含む。]
[0076] 本明細書において使用されるように、「モノクローナル抗体」は、たった１つの標的抗原に対して向けられる、高度に特異的な抗体である抗体を意味する。モノクローナル抗体は、同種の抗体または実質的に同種の抗体の集団から得られてもよく、それぞれのモノクローナル抗体は、若干、生じる可能性のある自然突然変異を除いて、同一でありそして／または同じエピトープに結合する。]
[0077] 「単離抗体」は、その自然環境の構成要素から分離されたもしくは回収されたかまたはその両方である、同定された抗体である。たとえば、酵素およびホルモンを含むタンパク質から分離される。一実施形態において、抗体は、抗体の少なくとも９５重量％または９６重量％または９７重量％または９８重量％または９９重量％まで精製される。純度は、たとえばローリー法によって決定することができる。通常、抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。]
[0078] 本明細書において使用される用語「結合剤」は、ＧＲＮ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合することができる任意の固体または非固体物質を指す。一実施形態において、この用語は、ＧＲＮ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する任意の天然分子または非天然分子を指す。結合剤の例は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、および小分子化合物を含む。選択的なまたは特異的な結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である。]
[0079] 本明細書において使用される試料または生物学的試料は、スクリーニングされることとなる対象から採取されるまたはそれに由来する任意の試料を意味する。試料は、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーが検出することができる、当技術分野において公知の任意の試料であってもよい。血漿、血液、唾液、間質液、血清、尿、滑液、脳脊髄液、リンパ液、精液、羊膜液、心臓周囲液、および腹水などの任意の体液ならびに心組織などの組織もまた含まれるが、これらに限定されない。]
[0080] 用語「エピトープ」は、免疫グロブリンおよび／またはＴ細胞受容体への特異的な結合ができる任意のタンパク質決定基を含む。それは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位である。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの、分子の化学的に活性な表面の群（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）から成り、通常、特異的な３次元構造の特徴および特異的な電荷の特徴を有する。エピトープは、典型的に、少なくとも３個、５個、または通常８〜１０個のアミノ酸を含む。アミノ酸は、隣接アミノ酸または三次フォールディングによって近接する非隣接アミノ酸であってもよい。]
[0081] 「発症または臨床提示の６時間以内」という用語は、たとえばＡＣＤ、心臓移植拒絶、または診断未確定のもしくは疑わしいＡＣＤ／肺障害の発症または医療施設での提示から、３６０分を含め、１分〜３６０分を含む。測定は、発症または症状から４時間（２４０分を含め、１分〜２４０分）以内に、２時間（１２０分を含め、１分〜１２０分）以内に、または１時間（６０分を含め、１分〜６０分）以内に、発症または提示の５〜４５分以内、１５〜４０分以内、２０〜３５分以内に、または２５〜３０分以内になされてもよい。]
[0082] コントロールもしくは対照標準値よりも「高い」もしくは「低い」レベルまたはコントロールもしくは対照標準値からの変化、差異、もしくは偏差は、一実施形態において、統計的に有意である。レベルが、コントロールレベルまたは対照標準値と比較して、約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、または約５０％以上、コントロールレベルまたは対照標準値と異なる場合、コントロールレベルもしくは対照標準値または平均コントロールレベルもしくは平均対照標準値からのより高いレベル、差異、より低いレベル、または偏差またはそれからの変化は、存在すると考えることができる。統計的に有意は、その代わりに、Ｐ≦０．０５として計算されてもよい。さらなる代案において、より高いレベル、より低いレベル、偏差および変化は、アッセイ対照標準限界またはアッセイ対照標準範囲により決定することができる。これらは、直感的な評価またはノンパラメトリック法から計算することができる。全体的に、これらの方法は、０．０２５および０．９７５の分位点（ｆｒａｃｔｉｌｅ）を０．０２５＊（ｎ＋１）および０．９７５（ｎ＋１）として計算する。そのような方法は、当技術分野において周知である２２、２３。コントロールにおいて不在のマーカー（ＧＲＮ−ＳＰを含む）の存在もまた、より高いレベル、偏差、または変化として予期される。コントロールにおいて存在するマーカー（ＧＲＮ−ＳＰを含む）の不在もまた、例えば、より低いレベル、偏差、または変化として予期される。]
[0083] グルコース処理障害、糖尿病、またはＡＣＤを含む生物学的事象または障害の病歴を有していない正常で健康な対象ならびに急性冠動脈症候群：提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴う（ＡＭＩ）、不安定狭心症、および急性非ＳＴ上昇ＭＩ；心虚血；急性心外傷；急性物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、および心臓移植拒絶を含むが、これらに限定されない様々なＡＣＤを有する対象からなどの、任意の対象から採取されるまたはそれに由来する試料が含まれる。]
[0084] 本明細書において使用される用語「心筋症」は、心筋層の疾患を指し、ここで、心筋層または心臓筋肉は、弱っている。これは、心臓のポンピングの低下をもたらし得る。心筋症の一般的な原因は、心臓発作、ウイルス感染症、高血圧、アルコール中毒症、および自己免疫疾患である。]
[0085] 本明細書において使用される「生物学的事象または障害」は、急性および慢性の状態の両方を含む、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーが対象の血行路へ放出される一連の事象を指す。例となる状態は、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、高血糖症、およびインスリン抵抗性を含む肥満症、糖尿病、腎疾患、グルコース処理障害；非アルコール性脂肪肝疾患（非アルコール性脂肪性肝炎を含む）および脂肪肝疾患（アルコール性肝疾患を含む）ならびに、心血管疾患（急性冠動脈症候群などだがこれらに限定されないＡＣＤを含む）などの代謝障害を含む。慢性の状態の例は、糖尿病および心血管疾患である。]
[0086] 用語ＧＲＮ−ＳＰは、ヒトプレプログレリン配列（配列番号１）についての、完全な２３アミノ酸のＧＲＮシグナルペプチドを指す。ＧＲＮ−ＳＰ（１〜２３）を、配列番号１５に単独で示す。ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーは、ＧＲＮ−ＳＰ、およびＧＲＮ−ＳＰの変異体または断片を含む、それから本質的に成る、またはそれから成るＧＲＮ−ＳＰ由来ポリペプチドまたはＧＲＮ−ＳＰ関連ポリペプチドを含む。ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーとして有用な断片は、ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）（配列番号１７）を含む。一実施形態において、ＧＲＮ−ＳＰは、シグナルポリペプチドとしてまたは抗体が結合することができる抗原性ポリペプチドとして機能する。ＧＲＮ−ＳＰの変異体および断片は、少なくとも抗原性結合機能を保持する変異体および断片を含む。]
[0087] 本明細書および特許請求の範囲において使用される用語「含む（comprising）」は、「〜から少なくとも部分的に成る（consisting at least in part of）」ことを意味する、すなわち、「含む（comprising）」を含む本明細書および特許請求の範囲における記載を解釈する場合、それぞれの記載においてこの用語によって前置きされた特徴はすべて、存在する必要があるが、他の特徴もまた、存在することができる。「含む（comprise）」および「含まれる（comprised）」などの関連する用語は、同様に解釈されることとなる。]
[0088] 本明細書において使用される用語「糖尿病」は、１型（真性糖尿病）および２型糖尿病の両方を包含する。１型糖尿病は、慢性高血糖症の状態として定義される。７．０ｍｍｏｌ／Ｌを超える静脈血漿空腹時グルコースレベルおよび／またはグルコース負荷試験の２時間後のもしくは無作為試料における１１．１ｍｍｏｌ／Ｌを超える値は、１型糖尿病を示す（Oxford Textbook of Medicine、Warrelｌら;第４版、２００５年、３１７頁を参照されたい）。]
[0089] 本明細書において使用される用語「グルコース処理障害」は、高血糖症および低血糖症の様々な状態を含む（メタボリックシンドロームを含む）。高血糖症状態は、グルコース寛容減損（ＩＧＴ）および空腹時グルコース減損（ＩＦＧ）を含む。７．０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の静脈血漿空腹時グルコースレベルおよび７．８ｍｍｏｌ／Ｌおよび１１．１ｍｍｏｌ／Ｌの間の、２時間でのグルコース負荷試験値は、ＩＧＴを示す。６．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／Ｌの空腹時グルコースレベルは、ＩＦＧを示す（Oxford Textbook of Medicine、前掲を参照されたい）。]
[0090] 本明細書において使用される用語「グルコース負荷試験」は、絶食の後に、２５０ｍｌの水中に溶解した７５ｇの無水グルコースを飲む対象に一般的に施される周知のグルコース試験を指す（Oxford Textbook of Medicine、前掲を参照されたい）。]
[0091] 本明細書において使用される用語「（１つまたは複数の）ポリヌクレオチド」は、任意の長さの単鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、非限定的な例として、遺伝子のコード配列および非コード配列、センス配列およびアンチセンス配列、エキソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリヌクレオチド、単離されそして精製された天然に存在するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマー、断片、遺伝子構築物、ベクター、ならびに修飾ポリヌクレオチドを含む。核酸分子に対する言及は、同様に理解されることとなる。]
[0092] 本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列の「断片」は、所望の標的に対する特異的なハイブリダイゼーションができる隣接するヌクレオチドの部分配列であり、たとえば、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである配列である。一実施形態において、本発明の断片は、配列番号１６のポリヌクレオチドの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、または６８の隣接するヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド配列の断片は、マイクロアレイ中に含ませて、プライマー、プローブとして使用することができるか、または本明細書におけるポリヌクレオチドベースの選択方法において使用することができる。本発明の他のポリヌクレオチドの断片（配列番号１８など）または本明細書において記載されるポリヌクレオチドの断片は、同様に理解されるはずである。たとえばＧＲＮ−ＳＰポリヌクレオチド配列番号１８において、断片は、配列番号１８の少なくとも１０、１１、１２、１３、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の隣接するヌクレオチドを有する。]
[0093] 用語「プライマー」は、鋳型にハイブリダイズし、標的に相補的なポリヌクレオチドのポリメリゼーションのプライミングに使用される、通常遊離３’ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドを指す。]
[0094] 用語「プローブ」は、ハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて、プローブに相補的なポリヌクレオチド配列を検出するために使用される短いポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書において定義される、ポリヌクレオチドの「断片」から成ってもよい。]
[0095] 本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結される、完全長配列を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。本発明において有用なポリペプチドは、精製天然産物であってもよいかまたは組換え技術もしくは合成技術を使用して部分的にもしくは全体的に生産されてもよい。用語は、ポリペプチド、二量体もしくは他の多量体などのポリペプチドの集合体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはその誘導体を指してもよい。本明細書におけるポリペプチドは、完全長ＧＲＮ−ＳＰタンパク質（配列番号１５）の少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、または少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３のアミノ酸すべての鎖長を有していてもよい。本発明の他のポリペプチド（配列番号１７など）または本明細書において記載される他のポリペプチドに対する言及は、同様に理解されるはずである。]
[0096] ポリペプチドの「断片」は、生物学的活性もしくは結合に必要とされるおよび／またはポリペプチドの３次元構造を提供する機能を果たす、ポリペプチドの部分配列である。その用語は、ポリペプチド、二量体もしくは他の多量体などのポリペプチドの集合体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはその誘導体を指してもよい。一実施形態において、断片は、上記のシグナルペプチド活性を果たすことができるかまたはＧＲＮ−ＳＰ（１〜２３）、ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）または本発明の他のポリペプチドもしくは本明細書において記載されるポリペプチドの抗原性結合特性を保持する。]
[0097] 本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用される用語「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、それらの自然の細胞環境から取り出される配列を指すために使用される。単離分子は、生化学的技術、組換え技術、および合成技術を含む任意の方法または生化学的技術、組換え技術、および合成技術を含む方法の組み合わせによって得られてもよい。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、少なくとも１つの精製工程によって調製されてもよい。]
[0098] 本明細書において使用される用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、完全な純度を必要としない。精製は、一実施形態において、試料におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド抗体、または宿主細胞の少なくとも９０％または９５％または９８％または９９％の均一性を指す。用語は、本明細書において記載される他の分子および構築物に関して同様に理解されるはずである。]
[0099] 細胞または宿主細胞に適用される用語「単離」は、生物からまたはその自然環境から得られたかまたは取り出され、引き続いて、当技術分野において公知である実験室環境において維持される細胞または宿主細胞を記載する。その用語は、それ自体、単細胞類（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ）自体に限定されないが、細胞培養物中に含まれる細胞または宿主細胞を指し、単細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）または単一の宿主細胞を含むことができる。]
[0100] 用語「組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は、その自然の状況においてそれを囲む配列から取り出されそして／またはその自然の状況において存在しない配列で組換えられるポリヌクレオチド配列を指す。]
[0101] 「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列から翻訳によって生産される。]
[0102] 本明細書において使用されるように、用語「変異体」は、明確に同定される配列とは異なるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指し、１〜１８またはそれを超えるヌクレオチド１〜６またはそれを超えるアミノ酸残基が、欠失している、置換されている、または追加されている。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８のヌクレオチドの置換が、特に企図される。１、２、３、４、５、または６のアミノ酸の置換、追加、または欠失もまた、企図される。変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体または天然に存在しない変異体であってもよい。変異体は、同じ種または他の種からのものであってもよく、相同体、パラログ、およびオルソログを包含していてもよい。ある実施形態において、本発明において有用なポリペプチドの変異体は、親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドと同じかまたは類似しているシグナルペプチド活性または抗原性結合特性を含む生物学的活性を有する。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関しての用語「変異体」は、本明細書において定義されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの形態をすべて包含する。]
[0103] 変異体ポリヌクレオチド配列は、本発明の配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を呈する。同一性は、少なくとも１０のヌクレオチド位置、少なくとも１５のヌクレオチド位置、少なくとも２０のヌクレオチド位置、少なくとも２７のヌクレオチド位置、少なくとも４０のヌクレオチド位置、少なくとも５０のヌクレオチド位置、少なくとも６０、もしくは少なくとも６５のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたり見つけられるかまたは配列番号１６のポリヌクレオチドの全長にわたり見つけられる。本明細書において開示される他のポリヌクレオチドについては、同一性は、同様に決定されてもよい。たとえば、配列番号１８については、比較ウィンドウは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７を超えるヌクレオチド位置であってもよい。]
[0104] ポリヌクレオチド配列同一性は、グローバル配列アライメントプログラム（global sequence alignment program）を使用して、候補ポリヌクレオチド配列および対象ポリヌクレオチド配列の間の重複の全長にわたり計算し得る（たとえばNeedleman, S. B.およびWunsch, C. D.（１９７０年）J. Mol. Biol. ４８巻、４４３〜４５３頁）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムの完全な実装は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／から得ることができるＥＭＢＯＳＳパッケージにおけるニードルプログラム（needle program）において見つけられる（Rice,P. Longden,I.、およびBleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite、Trendsin Genetics ２０００年６月、１６巻、６号、２７６〜２７７頁）。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサーバーもまた、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で、２つの配列の間でＥＭＢＯＳＳ−ニードルグローバルアライメントをオンラインで実行するための機能を提供している。]
[0105] その代わりに、末端ギャップにペナルティーを課さずに、２つの配列の最適なグローバルアライメントを算出するＧＡＰプログラムが、使用されてもよい。ＧＡＰは、以下の論文において記載されている。Huang, X.（１９９４年）On Global Sequence Alignment（Computer Applications in the Biosciences １０巻、２２７〜２３５頁）。]
[0106] ポリヌクレオチド変異体はまた、それらの配列の機能的等価性を保つであろう１つまたは複数の明確に同定された配列に対して類似性を呈し、偶然によって生じたことを合理的に予想することができないものをも包含する。このプログラムは、配列間での、類似性の領域を見つけ、それぞれのそのような領域について、ランダム配列を含有する固定基準サイズのデータベースにおいて、そのようなマッチが偶然見られることを予想することができる回数の期待数である「Ｅ値」を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおいてデフォルトに設定されている。１よりもかなり低い、小さなＥ値については、Ｅ値は、ほぼ、そのようなランダムマッチの蓋然性がある。]
[0107] 変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、明確に同定された配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０−５未満、１×１０−６未満、１×１０−９未満、１×１０−１２未満、１×１０−１５未満、１×１０−１８未満、または１×１０−２１未満のＥ値を呈する。]
[0108] ポリヌクレオチド配列同一性および類似性はまた、以下の方法において決定することもできる。対象ポリヌクレオチド配列は、配列アライメントアルゴリズムならびにＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴおよび他のデータベースなどの配列類似性検索ツールを使用して、候補ポリヌクレオチド配列と比較される。Nucleic AcidsRes ２９巻：１〜１０頁および１１〜１６頁、２００１年は、オンラインリソースの例を提供する。]
[0109] ＢＬＡＳＴＮの使用は、本発明によるポリヌクレオチド変異体についての配列同一性の決定において使用するのに好ましい。]
[0110] ＢＬＡＳＴＮ（ｂｌ２ｓｅｑにおけるプログラムのＢＬＡＳＴスーツ、バージョン２．２．１８ ２００８年４月から）（Tatiana A.ら、FEMS Microbiol Lett. １７４巻：２４７〜２５０頁（１９９９年）、Altschulら、Nuc.Acis Res ２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）またはＢｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡのＮＣＢ１から公的に入手可能である。ローコンプレキシティパート（low complexity part）のフィルタリングをオフにするべき以外は、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用される。]
[0111] ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のＵＮＩＸ（登録商標）コマンドラインパラメーターを使用して検査されてもよい。
ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１ −ｊ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２ −Ｆ Ｆ −ｐ ｂｌａｓｔｎ
パラメーター−Ｆ Ｆは、ローコンプレキシティセクション（low complexity section）のフィルタリングをオフにする。パラメーター−ｐは、配列のペアに適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、「同一性＝」という行において同一のヌクレオチドの数およびパーセンテージの両方として配列同一性を報告する。]
[0112] その代わりに、変異体ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、指定されるポリヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。]
[0113] 用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」およびその文法的な等価物は、温度および塩濃度の規定された条件下で、標的ポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子の能力を指す（サザンブロットまたはノーザンブロットなどのＤＮＡブロットまたはＲＮＡブロット上に固定された標的ポリヌクレオチド分子など）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力は、それほどストリンジェントではない条件下で最初にハイブリダイズし、次いで、望ましいストリンジェンシーまでストリンジェンシーを増加させることによって決定することができる。]
[0114] 長さが約１００塩基よりも大きなポリヌクレオチド分子に関して、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、未変性二重鎖の融解温度（Ｔｍ）以下の、２５〜３０℃以下（たとえば１０℃）である（一般的に、参照によって本明細書において組み込まれるSambrookら編、１９８７年、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版 Cold Spring Harbor Press;Ausubelら、１９８７年、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishingを参照されたい）。約１００塩基よりも大きなポリヌクレオチド分子についてのＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋）によって計算することができる（Sambrookら編、１９８７年、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版 Cold Spring Harbor Press;BoltonおよびMcCarthy、１９６２年、PNAS ８４巻：１３９０頁）。長さが１００塩基よりも大きなポリヌクレオチドについての典型的なストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中での予洗；６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで、一晩のハイブリダイズ；その後、６５℃での、それぞれ１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での３０分間の２回の洗浄、および６５℃での、それぞれ０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での３０分間の２回の洗浄などのハイブリダイゼーション条件になるであろう。]
[0115] 一実施形態において、ストリンジェントな条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを使用し、５５℃の０．２×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中での４２℃での洗浄、その後、５５℃での、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる洗浄液で洗浄する。]
[0116] １００基礎未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関して、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ以下の５〜１０℃である。平均で、１００ｂｐ未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍは、ほぼ、（５００／オリゴヌクレオチド長）℃、低下する。]
[0117] ペプチド核酸（ＰＮＡ）として公知のＤＮＡ模倣物に関して（Nielsenら、Science. １９９１年１２月６日；２５４巻（５０３７号）：１４９７〜５００頁）、Ｔｍ値は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドについてのものよりも高く、Giesenら、Nucleic AcidsRes. １９９８年１１月１日; ２６巻（２１号）：５００４〜６頁において記載される式を使用して計算することができる。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドについての例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ以下の５〜１０℃である。]
[0118] 変異体ポリヌクレオチドはまた、本発明の配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに類似する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない配列改変は、「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、同じアミノ酸についての他のコドンは、たとえば、特定の宿主生物においてコドン発現を最適化するために、当技術分野で認識されている技術によって変化させてもよい。]
[0119] その生物学的活性を著しく変えることなく、コードされたポリペプチド配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換をもたらすポリヌクレオチド配列改変もまた、本発明において含まれる。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をなすための方法を認識しているであろう（たとえばBowieら、１９９０年、Science ２４７巻、１３０６頁を参照されたい）。]
[0120] コードされたポリペプチド配列におけるサイレント変異および保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、上記に記載されるように、ｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムを介して、ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定されてもよい。]
[0121] ポリペプチドに関しての用語「変異体」はまた、天然に存在するポリペプチド、組換えで生産されたポリペプチド、および合成的に生産されたポリペプチドをも包含する。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、本発明の配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を呈する。同一性は、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２１、または少なくとも２２のアミノ酸位置の比較ウィンドウにわたり見つけられるかまたは配列番号１５のポリペプチドまたは本発明において開示されるかもしくは使用される他のポリペプチドの全長にわたり見つけられる。たとえば、配列番号１７については、比較ウィンドウは、少なくとも５、６、７、もしくは８のアミノ酸位置にわたってもよいまたはポリペプチドの全長にわたっていてもよい。]
[0122] ポリペプチド変異体はまた、それらの配列の機能的等価性を保つ可能性がある１つまたは複数の明確に同定された配列に対して類似性を呈し、偶然によって生じたことを合理的に予想することができないものをも包含する。上記に論じられるように、ＧＲＮ−ＳＰ変異体の場合には、機能は、シグナルポリペプチドもしくは抗原性ポリペプチドまたはその両方であってもよい。]
[0123] ポリペプチド配列同一性および類似性は、以下の方法において決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌ２ｓｅｑにおけるプログラムのＢＬＡＳＴスーツ、バージョン２．２．１８［２００８年４月］から）を使用して、候補ポリペプチド配列と比較されるが、これは、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に入手可能である。ローコンプレキシティ領域（low complexity region）のフィルタリングをオフにするべき以外は、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用される。]
[0124] ポリペプチド配列の類似性は、以下のＵＮＩＸ（登録商標）コマンドラインパラメーターを使用して検査されてもよい。
ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１ −ｊ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２ −Ｆ Ｆ −ｐ ｂｌａｓｔｐ
パラメーター−Ｆ Ｆは、ローコンプレキシティセクションのフィルタリングをオフにする。パラメーター−ｐは、配列のペアに適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列の間での、類似性の領域を見つけ、それぞれのそのような領域について、ランダム配列を含有する固定基準サイズのデータベースにおいて、そのようなマッチが偶然見られることを予想することができる回数の期待数である「Ｅ値」を報告する。１よりもかなり低い、小さなＥ値については、これは、ほぼ、そのようなランダムマッチの蓋然性がある。]
[0125] 変異体ポリペプチド配列は、一般的に、明確に同定された配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０−５未満、１×１０−６未満、１×１０−９未満、１×１０−１２未満、１×１０−１５未満、１×１０−１８未満、または１×１０−２１未満のＥ値を呈する。]
[0126] ポリペプチド配列同一性もまた、グローバル配列アライメントプログラムを使用して、候補ポリペプチド配列および対象ポリペプチド配列の間の重複の全長にわたり計算し得る。ＥＭＢＯＳＳ−ニードル（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で入手可能）およびGAP（Huang, X.（１９９４年）On Global Sequence Alignment Computer Applications in the Biosciences １０巻、２２７〜２３５頁）はまた、上記に論じられるように、ポリペプチド配列同一性を計算するのに適したグローバル配列アライメントプログラムでもある。]
[0127] 上記に記載されるＢＬＡＳＴＰの使用は、本発明によるポリペプチド変異体の決定において使用するのに好ましい。]
[0128] 一実施形態において、変異体は、配列が、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える保存的アミノ酸置換、欠失、追加または挿入によって、本明細書におけるヒトＧＲＮ−ＳＰ（１〜２３）配列番号１５、またはＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）配列番号１７とは異なるペプチドであって、保存的突然変異は、ペプチドの生物学的活性に影響しないペプチドを含む。保存的置換は、典型的に、一つのアミノ酸による、類似する特徴を有する別のアミノ酸を代える置換、たとえば以下のグループ内の置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンを含む。保存的置換の例はまた、ヒト配列と比較される、異なる哺乳動物種における置換が示される配列表において示されるように、ＧＲＮ−ＳＰの配列においても見つけることができる。他の保存的置換は、下記の図８および表１から得ることができる。] 図８
[0129] 天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、グループ分けされる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ：
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、他のクラスのメンバーとの交換を伴うであろう。]
[0130] 他の変異体は、ペプチド安定性に影響を及ぼす改変を有するペプチドを含む。そのような類似体は、たとえば、ペプチド配列において、１つまたは複数の非ペプチド結合（ペプチド結合に取って代わる）を含有していてもよい。天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、たとえば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸、たとえばベータアミノ酸もしくはガンマアミノ酸および環状類似体を含む類似体もまた含まれる。]
[0131] 置換、欠失、追加、または挿入は、当技術分野において公知の突然変異誘発方法によってなされてもよい。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をなす方法を認識しているであろう。たとえばBowieら、１９９０年、Science ２４７巻、１３０６頁９、Kunkel, T; １９８５年、PNAS, ８５巻４８８頁２７を参照されたい。]
[0132] 合成の間にまたは合成の後に、たとえばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、リン酸化、アミド化によって、ブロッキング基／保護基を使用する誘導体化、およびその他同種のものによって改変されたものもまた本発明のポリペプチドに含まれる。そのような改変は、ポリペプチドの安定性または活性を増加させてもよい。そのような改変は、当技術分野において周知である。たとえばSambrookおよびAusubel（前掲）ならびにLundblad, R、CRCPress、１９９５年２８を参照されたい。]
[0133] 用語「遺伝子構築物」は、ポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指し、これは、これに限定されないが、ｃＤＮＡ分子などの他のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）をそれに挿入していてもよい。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、任意選択で、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする、必要なエレメントを含有していてもよい。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来してもよいしまたは異なる細胞もしくは異なる生物に由来してもよいしかつ／または組換えポリヌクレオチドであってもよい。一度、宿主細胞の内部に入ると、遺伝子構築物は、宿主染色体ＤＮＡ中に組み込まれるようになり得る。遺伝子構築物は、ベクターに連結されてもよい。]
[0134] 用語「ベクター」は、ポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指し、これは、宿主細胞へ遺伝子構築物を運搬するために使用される。ベクターは、E. coliなどの少なくとも１つのさらなる宿主系において複製ができてもよい。]
[0135] 用語「発現構築物」は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、任意選択で、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする、必要なエレメントを含む遺伝子構築物を指す。発現構築物は、典型的に、５’から３’方向に、
（ａ）構築物が形質転換される宿主細胞における機能的なプロモーター、
（ｂ）発現されることとなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）構築物が形質転換される宿主細胞における機能的なターミネーターを含む。]
[0136] 用語「コード領域」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、適切な調節配列のコントロール下で、転写産物および／またはポリペプチドを生産することができる、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンの存在によって同定される。遺伝子構築物に挿入される場合、「コード配列」は、それが、プロモーター配列およびターミネーター配列ならびに／または他の調節エレメントに作動可能に連結される場合、発現することができる。]
[0137] 「調節エレメント」および「ポリヌクレオチド調節エレメント」は、ベクター、遺伝子構築物、または発現カセットからのポリヌクレオチド挿入物の発現をコントロールするかまたはそれに影響を及ぼし、プロモーター、転写コントロール配列、翻訳コントロール配列、複製開始点、組織特異的調節エレメント、一過性調節エレメント、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リプレッサー、およびターミネーターを含む任意のエレメントを意味する。調節エレメントは、本発明によるベクター、遺伝子構築物、または発現カセットから発現されることとなるポリヌクレオチド挿入物に対して同種または異種であってもよい。]
[0138] ポリヌクレオチド調節エレメント（ＰＲＥ）およびＰＲＥが遺伝子構築物において作動可能に連結される配列の間の関係に関して本明細書において使用される「同種」は、ＰＲＥが、それが構築物において作動可能に連結されるコード配列と、通常、自然状態では関連することを意味する。同種のポリヌクレオチド調節エレメントは、所望のポリヌクレオチドが、本発明によるベクター、遺伝子構築物、または発現カセットから発現することができるように、所望のポリヌクレオチドに作動可能に連結されてもよい。]
[0139] ポリヌクレオチド調節エレメント（ＰＲＥ）およびＰＲＥが遺伝子構築物において作動可能に連結される配列の間の関係に関して本明細書において使用される「異種」は、ＰＲＥが、それが構築物において作動可能に連結されるコード配列と、通常、自然状態では関連していないことを意味する。そのようなＰＲＥは、通常、異なる遺伝子（ＡＮＰ以外の）と関連するプロモーターおよび／または任意の他の細菌、ウイルス、真核生物、もしくは哺乳動物の細胞から単離されるプロモーターを含んでいてもよい。]
[0140] 「作動可能に連結される」は、発現されることとなる配列が、プロモーター、転写コントロール配列、翻訳コントロール配列、複製開始点、組織特異的調節エレメント、一過性調節エレメント、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リプレッサー、およびターミネーターを含む調節エレメントのコントロール下に配置されることを意味する。]
[0141] 用語「非コード領域」は、翻訳開始部位の上流および翻訳終止部位の下流にある非翻訳配列を指す。これらの配列はまた、それぞれ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとも呼ばれる。これらの領域は、転写開始および転写終結ならびに翻訳効率の調節に必要とされるエレメントを含む。]
[0142] ターミネーターは、転写を終結させ、翻訳配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端において見つけられる配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定基で、いくつかの場合には、空間的な調節機能を有することが見つけられた。]
[0143] 用語「プロモーター」は、遺伝子転写を調節する、コード領域の上流の非転写シス調節エレメントを指す。プロモーターは、転写開始部位およびＴＡＴＡボックスなどの保存ボックスならびに転写因子が結合するモチーフを特定するシスイニシエーターエレメントを含む。]
[0144] 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「発現を改変する」および「発現の改変」という用語は、本発明のポリヌクレオチドに対応するゲノムＤＮＡが、改変され、したがって、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の改変に至る状況を包含するように意図される。ゲノムＤＮＡの改変は、遺伝子形質転換または突然変異を誘発するための、当技術分野において公知の他の方法によるものであってもよい。「発現の改変」は、生産されるメッセンジャーＲＮＡおよび／またはポリペプチドの量の増加または減少に関するものとすることができ、また、生産されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列における改変により、ポリペプチドの活性の改変をもたらしてもよい。]
[0145] 本明細書において使用される「対象」は、好ましくは、哺乳動物であり、ヒトならびにネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、マウス、ラット、霊長動物（ゴリラ、アカゲザル、およびチンパンジーを含む）、ポッサム、ならびに他の家畜動物または動物園の動物などの非ヒト哺乳動物を含む。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。]
[0146] 本明細書において使用される用語「提示」は、クリニックまたは病院などの医療施設での対象の提示を指す。]
[0147] 本明細書において使用される「治療有効量」または「治療有効用量」は、望ましい生理的効果をもたらすのに十分な量または特に、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは徴候を低下させるかもしくは取り除くことを含む、所望の疾患または状態の治療に対し、望ましい結果を達成することができる量を意味する。]
[0148] 用語「治療する」「治療すること」、または「治療」および「予防すること」は、グルコース処理障害、糖尿病、高血糖症、肥満症、心血管疾患、ＡＣＤ、もしくは心臓移植拒絶またはその影響、特にＡＣＳの影響を含む、正常なコントロールレベルからの偏差を示すＧＲＮ−ＳＰレベルによって特徴づけられる生物学的事象の進行を緩和する、回復させる、管理する、予防する、抑制する、停止させる、または逆戻りさせる治療手段または予防手段を指す。対象は、グルコース、ラクテート、インスリン、脂肪酸、トリグリセリド、Ｔｎ、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＢＮＰ、Ｎ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ（およびその断片）、ＡＮＰ、ＡＮＰ−ＳＰ（およびその断片）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ミオグロビン、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｈ−ＦＡＢＰ、虚血修飾アルブミン、エンドセリン、アドレノメデュリン、レニン、アンギオテンシンＩＩ、および、改善を示す、当業者らに公知の他の通例の臨床的マーカーのうちの１つまたは複数における、観察可能なまたは測定可能な（統計的に有意な）低下を示し得る。]
[0149] 本明細書において使用される用語「マススペクトロメトリー」は、電荷に対するイオンの質量比に基づき、イオンを濾過し、検出し、測定するための方法を指す。たとえば米国特許第５，７１９，０６０号、米国特許第６，２０４，５００号、米国特許第６，１０７，６２３号、米国特許第６，１２４，１３７号、米国特許第６，２２５，０４７号、米国特許第６，２６８，１４４号、米国特許第７，０５７，１６５号、および米国特許第７，０４５，３６６号を参照されたい。一般的なマススペクトロメトリー技術は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）および表面増強レーザー脱離イオン化法（surface-enhanced laser desorption ionization）（ＳＥＬＤＩ）を含む。両方とも、非常に短いイオンパルスでフェムトモルレベルで分析物の分析を可能にする飛行時間型分析機器とつながれてもよい（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）。]
[0150] 本発明において有用である、たとえば米国特許第５，７１９，６００号、米国特許第６，１２４，１３７号、および米国特許第６，２２５，０４７号において論じられるＳＥＬＤＩのバージョンは、表面増強アフィニティーキャプチャー（Surface-Enhanced Affinity Capture）（ＳＥＡＣ）、表面増強ニート脱離（Surface-Enhanced Neat Desorption）（ＳＥＮＤ）、ならびに表面増強感光性アタッチメントおよびリリース（Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release）（ＳＥＰＡＲ）を含む。]
[0151] 本明細書において開示される一連の数に対する言及（たとえば１〜１０）は、また、その範囲内のすべての関連する数に対する言及をも組み込み（たとえば１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、および１０）、また、その範囲内の有理数の任意の範囲をも組み込むことが意図され（たとえば２〜８、１．５〜５．５、および３．１〜４．７）、そのため、本明細書において明確に開示されるすべての範囲のすべての部分範囲は、明確に開示される。これらは、明確に意図されるものについてのほんの例であり、列挙される最低値および最高値の間の数値の可能なすべての組み合わせが、同様に、本出願において明確に述べられると考えられる。]
[0152] 発明の詳細な説明
グレリン（ＧＲＮ）は、胎盤、腎臓、視床下部、および脳下垂体における内分泌細胞によって生産されるポリペプチドホルモンである。胃（グレリン生産の主な部位）において、胃底を内張りする上皮細胞は、グレリンを生産する。グレリンは、エネルギーバランスの調節に関与する。グレリンは、視床下部摂食中枢を活性化することによって、個人における食欲増進、食物消費増加、および最終的に体重を増加させるように作用する。グレリンによって、高血糖症は誘発され、インスリン放出は阻害される。グレリンおよびその受容体はまた、心血管組織においても見つけられる（Garcia, Eら; Ghrelin and Cardiovascular health、Current Opinion in Pharmacology、６巻、２号、２００６年、１４２〜１４７頁）。配列番号１が示すように、プレプロＧＲＮは、１１７アミノ酸分子である。それは、ジスルフィド（disulsphide）架橋によって連結される２つのポリペプチド鎖（ＡおよびＢ）から成る。プレプログレリン（１〜１１７）は、切断されて、２３アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号１５）、９４アミノ酸のプログレリン、および２８アミノ酸のグレリンホルモンを生じる。ヒトプレプログレリンのプロセシングを図５に示す。] 図５
[0153] ＧＲＮ−ＳＰの機能的役割は、小胞体におけるグレリンの輸送のコントロールに限られていると長く考えられてきた。一度、これが達成されると、次いで、シグナルペプチドは、細胞からなお分泌されることなく分解されると仮定されてきた２５。]
[0154] 従来の見解に反論する(ｃｏｎｆｏｕｎｄ)ものであるが、本出願人らは、典型的にＧＲＮ−ＳＰ断片の形態のＧＲＮ−ＳＰが、血行路中に出現することを、今や発見した。この発見自体は、ＧＲＮ−ＳＰおよびＧＲＮ−ＳＰ断片が、一連の生物学的事象もしくは障害についての循環バイオマーカーとして有用であることを意味する。たとえば、糖尿病患者および診断未確定の糖尿病患者において、たとえば、ＧＲＮ−ＳＰのレベルは、対象が、低インスリン血症であるかまたは高インスリン血症であるかどうかに依存して、正常なコントロールレベルまたは対照標準レベルを超えるかまたはそれを下回ることが予想される。上記低レベルは、インスリン作用または分泌における欠乏の症状である。]
[0155] したがって、一態様において、本発明は、対象における生物学的事象もしくは障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、事象もしくは障害は、血行路への、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの放出と相互に関連し、
（ａ）対象からの生物学的試料中のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および
（ｂ）ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロールまたは対照標準レベルからのＧＲＮ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、
コントロールレベルまたは対照標準レベルからの、測定レベルにおける偏差は、生物学的事象または障害を示す方法を提供する。]
[0156] 生物学的事象または障害は、グルコース処理障害、糖尿病、およびＡＣＤを含む。]
[0157] そのため、本発明はまた、対象におけるグルコース処理を評価するための方法であって、
（ａ）グルコースの投与の後に、対象におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程；
（ｂ）上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロールまたは対照標準レベルからのＧＲＮ−ＳＰと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準レベルからのＧＲＮ−ＳＰの測定レベルにおける偏差は、グルコース処理障害を示す方法をも提供する。]
[0158] 一般的に、偏差は、コントロールレベルと比較して、より低いＧＲＮ−ＳＰの測定レベルになるであろう。たとえば高血糖症を有する対象において３１。]
[0159] この方法において、グルコースは、周知のグルコース負荷試験プロトコールに従って、第１のステップとして投与されてもよい（Oxford Textbook of Medicine、前掲）。]
[0160] ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー、通常静脈血漿ＧＲＮ−ＳＰの血漿濃度の評価は、グルコース試験が標準的なプロトコールに従って施された２時間後になされてもよい。しかしながら、グルコースの投与の後の、たとえば１５、３０、４５、６０、９０、および１０５分後の中間の測定もまた有用である。]
[0161] 本発明はまた、対象における糖尿病または糖尿病の可能性を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、
（ａ）対象からの生物学的試料中のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および
（ｂ）ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロールまたは対照標準からのＧＲＮ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、
コントロールまたは対照標準レベルよりも高いかまたは低いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、糖尿病または糖尿病に対する素因を示す３１方法をも提供する。]
[0162] ＩＮＳ−ＳＰバイオマーカーレベルが正常よりも高いかまたは低いかどうかは、対象のインスリン状態に依存する。]
[0163] 出願人らは、驚いたことに、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を有する患者において、ＧＲＮ−ＳＰの循環濃度が、患者の症状の発症後の最初の数時間において−実際に、病院またはクリニックへの提示の時に最も高いことを発見した。最初の２〜６時間または４時間において観察されるレベルは、驚いたことに、非常に高く、多くの場合、正常なコントロール集団におけるレベルよりもおよそ１．５〜５倍、一般には２〜３倍高いピークに達する。ＡＣＤ、心臓移植拒絶についてのマーカーとしてまたは診断未確定のＡＣＤもしくは疑わしいＡＣＤもしくは肺障害での使用のためのマーカーとしてのグレリンまたはＧＲＮ−ＳＰまたはＧＲＮ−ＳＰ断片の使用については以前には示唆されていない。]
[0164] これらの発見は、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーが、心臓移植拒絶、ＡＭＩなどの急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を含むＡＣＤ、特に非ＳＴ上昇ＭＩ、および急性心虚血の非常に明瞭な初期段階マーカーとして有用であり、ＡＣＤを肺障害から区別するために使用できることを示唆する。]
[0165] これらの驚くべき発見に基づいて、本出願人らは、それが、特に障害の発症の約６、約４、もしくは約２時間以内にまたは障害の臨床提示のときに、対象から採取した生物学的試料中の循環ＧＲＮ−ＳＰまたはその変異体もしくは断片ならびにまたは代わりに、ＧＲＮ−ＳＰもしくはその変異体および断片をコードするヌクレオチド配列に対してスクリーニングするのに有用であろうということを初めて決定した。]
[0166] 本発明において有用なのは、長さが最小４または５のアミノ酸であるＧＲＮ−ＳＰの抗原性断片または変異体である。わずか４つのアミノ酸を有するペプチドは、生物学的に活性であることが公知である。たとえば、Gilchristら、Biology and Reproduction, ２１巻、７３２〜７３９頁、２００４年ならびにSelaら、Behring Ins. Mitt., ９１巻、５４〜６６頁、１９９２年を参照されたい。特に有用な断片は、ＧＲＮ−ＳＰのＮ末端（１〜９）またはＣ末端にある。特異的な抗原性ペプチドの例は、ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）（配列番号１７）である。対応するヌクレオチド配列は、配列番号１８に示す。この配列は、出願人らによって初めて提供される。核酸分子およびペプチド形態の両方は本発明の態様として形成する。]
[0167] したがって、他の態様において、本発明は、ＧＲＮ−ＳＰ断片をコードする核酸分子であって、上述の核酸は、
（ａ）配列番号１８またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、
（ｃ）配列番号１８またはその断片もしくは変異体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体であり、
ただし、配列が配列番号１６ではないということを条件とする核酸分子を提供する。配列番号１６は、シグナルペプチドをコードする完全長核酸配列である。]
[0168] 本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされる、単離ＧＲＮ−ＳＰポリペプチドおよびＧＲＮ−ＳＰ断片を提供する。]
[0169] 本発明の特定のポリペプチドは、すべて添付の配列表に記載される配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本明細書において規定されるこれらのポリペプチドの変異体および断片または配列番号１７のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列もまた企図される。一実施形態において、変異体または断片は、機能的に等価な変異体または断片である。すなわち、変異体または断片は、抗原またはシグナルペプチドとしての配列番号１７の機能を維持する。公知の完全長ＧＲＮ−ＳＰ（１〜２３）配列番号１５は、もちろんそれ自体請求されていないが、本発明において有用である。たとえば、このポリペプチドは、抗ＧＲＮ−ＳＰ抗体の調製において使用されてもよい。]
[0170] 本発明のまたはそうでなければ本明細書において記載される核酸分子は、一実施形態において、単離される。それらは、当業者らに公知の様々な技術を使用して、生物学的試料から単離されてもよい。例として、そのようなポリヌクレオチドは、Mullisら編、１９９４年 The Polymerase Chain Reaction、Birkhauserにおいて記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通して単離することができる。本発明の核酸分子は、本発明のポリヌクレオチド配列に由来する、本明細書において規定されるプライマーを使用して増幅することができる（たとえば、Mullis, Sambrook前掲およびMolecular Diagnostic PCR Handbook Gerrit, Vら、Springer、２００５年を参照されたい）。]
[0171] ポリヌクレオチドを単離するためのさらなる方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしての、本発明のポリヌクレオチド、特に配列番号１８において記載される配列を有するポリヌクレオチドのすべてまたは部分の使用を含む。ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜などの固体支持体上に固定されたポリヌクレオチドに、標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズするための技術は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。同様に、プローブは、ビーズに結合し、標的配列にハイブリダイズされてもよい。単離は、磁気分離などの公知の技術プロトコールを使用して達成することができる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、上記に示されるとおりである。]
[0172] ポリヌクレオチド断片は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびオリゴヌクレオチド合成などの、当技術分野において周知の技術によって生産されてもよい。]
[0173] 部分的なポリヌクレオチド配列は、試料における対応する完全長ポリヌクレオチド配列を同定するために、当技術分野において周知の方法において、プローブとして使用されてもよい。そのような方法は、ＰＣＲベースの方法、５’ＲＡＣＥ（MethodsEnzymol. ２１８巻：３４０〜５６頁（１９９３年）；Sambrookら、前掲）、およびハイブリダイゼーションベースの方法、コンピューター／データベースベースの方法を含む。放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、および生物発光標識などの検出可能な標識は、検出を容易にするために使用されてもよい。逆ＰＣＲはまた、公知の領域に基づくプライマーから始めて、本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列の側面に位置する未知の配列の獲得を可能にする（Trigliaら、Nucleic Acids Res １６巻、８１８６頁、（１９９８年））。方法は、遺伝子の公知の領域において適した断片を生成するためにいくつかの制限酵素を使用する。次いで、断片は、分子内ライゲーションによって環状化され、ＰＣＲ鋳型として使用される。異なるプライマーは、公知の領域から設計される。完全長クローンを物理的に構築するために、標準的な分子生物学アプローチを利用することができる（Sambrookら、前掲）。本発明のポリヌクレオチドの増幅を可能にするプライマーおよびプライマーペアはまた、本発明のさらなる態様をも形成する。]
[0174] 変異体（オルソログを含む）は、記載される方法によって同定されてもよい。変異体ポリヌクレオチドは、ＰＣＲベースの方法を使用して同定されてもよい（Mullisら編 １９９４年 The Polymerase Chain Reaction、Birkhauser）。典型的に、ＰＣＲによってポリヌクレオチド分子の変異体を増幅するのに有用なプライマーのポリヌクレオチド配列は、対応するアミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づいてもよい。]
[0175] 変異体ポリヌクレオチドを同定するためのさらなる方法は、上記に記載されるように、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、ハイブリダイゼーションプローブとしての特定されるポリヌクレオチドのすべてまたは部分の使用を含む。典型的に、対応するアミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づくプローブが使用されてもよい。ハイブリダイゼーション条件もまた、プローブに同一の配列をスクリーニングする場合に使用される条件よりもストリンジェントではなくてもよい。]
[0176] ポリヌクレオチド変異体およびポリペプチド変異体の両方を含む変異体配列はまた、上記に論じられる、コンピューターベースの方法によって同定されてもよい。]
[0177] さらに、関連する配列のグループの複数回の配列アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompsonら、Nucleic AcidsResearch, ２２巻：４６７３〜４６８０頁（１９９４年）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ＢｉｏＩｎｆｏ／ＣｌｕｓｔａｌＷ／Ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）またはＴ−ＣＯＦＦＥＥ（Cedric Notredameら、J. Mol. Biol. ３０２巻：２０５〜２１７頁（２０００年）））または累進的ペアワイズアライメントを使用するＰＩＬＥＵＰ（Fengら、J. Mol. Evol. ２５巻、３５１頁（１９８７年））を用いて実行することができる。]
[0178] パターン認識ソフトウェアアプリケーションは、モチーフまたはシグネチャ配列を発見するのに利用可能である。たとえば、ＭＥＭＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｔｉｆ Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）は、配列のセットにおけるモチーフおよびシグネチャ配列を見つけ、ＭＡＳＴ（Ｍｏｔｉｆ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、クエリー配列における類似するまたは同じモチーフを同定するために、これらのモチーフを使用する。ＭＡＳＴ結果は、適切な統計データおよび見つけられたモチーフの視覚的全体像と共に、一連のアライメントとして提供される。ＭＥＭＥおよびＭＡＳＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏで開発された。]
[0179] ＰＲＯＳＩＴＥ（Bairochら、Nucleic AcidsRes. 22巻、３５８３頁（１９９４年）；Hofmannら、Nucleic Acids Res. ２７巻、２１５頁（１９９９年））は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列から翻訳される、特徴づけられていないタンパク質の機能を同定するための方法である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ）は、生物学的に有意なパターンおよびプロファイルを含有し、タンパク質の公知のファミリーに新しい配列を割り当てるために、またはどの（１つもしくは複数の）公知のドメインが配列中に存在するかを決定するために、適切なコンピューターツールと共にそれを使用することができるように設計されている（Falquetら、Nucleic Acids Res. ３０巻、２３５頁（２００２年））。Ｐｒｏｓｅａｒｃｈは、所与の配列パターンまたはシグネチャを用いてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＥＭＢＬのデータベースを検索することができるツールである。]
[0180] タンパク質は、同じゲノム（パラログ）または異なるゲノム（オルソログ）における他のタンパク質に対するそれらの配列関連性に従って分類することができる。オルソロガス遺伝子は、共通の祖先の遺伝子からの種分化によって進化し、それらが進化させるのと同じ機能を通常保持する遺伝子である。パラロガス遺伝子は、ゲノム内で重複している遺伝子であり、遺伝子は、本来のものに関する可能性がある新しい特異性または修飾機能を獲得する可能性がある。系統発生解析法は、Tatusovら、Science ２７８巻、６３１〜６３７頁、１９９７年において概説される。]
[0181] 上記に述べられるように、本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされるＧＲＮ−ＳＰポリペプチドにも関し、これらのポリペプチドの変異体および断片を含む。]
[0182] 上記に記載されるコンピューター／データベース方法に加えて、ポリペプチド変異体は、物理的方法によって、たとえば、本発明のポリペプチドに対して産生させた抗体を使用して発現ライブラリーをスクリーニングすることによって（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版 Cold Spring Harbor Press、１９８７年）、またＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される組換えＤＮＡ技術によって、またはそのような抗体の助けによって自然源からポリペプチドを同定することによって同定されてもよい。]
[0183] 変異体ポリペプチドを含むポリペプチドは、固相技術を使用する直接的なペプチド合成（たとえばMerrifield、１９６３年、in J. Am Chem. Soc. ８５巻、２１４９頁；Stewartら、１９６９年、Solid-Phase Peptide Synthesis、WH Freeman Co、San Francisco California；Matteucciら J. Am. Chem. Soc. １０３巻：３１８５〜３１９１頁、１９８１年、およびAthertonら、Solid Phase Peptide Synthesis: a practical approach,. IRL press（１９８９年））またはたとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からのシンセサイザーを使用する自動合成などの、当技術分野において周知のペプチド合成方法を使用して調製されてもよい。ポリペプチドの突然変異形態はまた、Adelmenら； DNA ２巻、１８３頁（１９８３年）によって記載されるように、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発などの合成方法を使用して生産されてもよい。Protein Protocols Handbook; Walker, J. Humana Press ２００２年もまた参照されたい。]
[0184] 本明細書におけるポリペプチドおよび変異体ポリペプチドは、一実施形態において単離される。それらは、当技術分野において周知の様々な技術を使用して、自然源から単離されてもよいしまたは精製されてもよい（たとえばDeutscher、１９９０年編、Methodsin Enzymology、１８２巻、Guide to Protein Purification, および Protein Protocols Handbook、前掲）。技術は、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。]
[0185] その代わりに、ポリペプチドおよび変異体ポリペプチドは、下記論じられるように、適した宿主細胞において組換えで発現され、細胞から分離されてよい。ポリペプチドおよび変異体は、他の使用の中でも、抗体を生成する際のおよびリガンドを生成する際の有用性を有する。]
[0186] 本明細書において記載される遺伝子構築物は、本発明の開示されるポリペプチドをコードする、１つまたは複数の開示されるポリヌクレオチド配列および／またはポリヌクレオチドを含んでいてもよく、たとえば、細菌、菌類、昆虫、哺乳動物、または植物の生物体を形質転換するのに有用であり得る。本発明の遺伝子構築物は、本明細書において規定される発現構築物を含むように意図される。ベクター（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵ１９、Ｍｐ１８、Ｍｐ１９、ＣｏｌＥ１、ＰＣＲ１、およびｐＫＲＣなど）、ファージ（ラムダｇｔ１０など）、ならびにＭ１３プラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＴ１２７、ＲＰ４、ｐ１Ｊ１０１、ＳＶ４０、およびＢＰＶなど）、コスミド、ＹＡＣＳ、ＢＡＣ、ｐＳＡ３などのシャトルベクター、ＰＡＴ２８トランスポゾン（米国特許第５，７９２，２９４号において記載されるものなど）、ならびにその他同種のものが含まれる。]
[0187] 構築物は、好都合に、選択遺伝子または選択可能マーカーを含んでいてもよい。典型的に、アンピシリン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンなどの抗生物質抵抗性マーカーが使用される。]
[0188] 構築物において有用なプロモーターは、当技術分野においてすべて周知のβ−ラクタマーゼプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター系、トリプトファンプロモーター系、およびｔａｃプロモーター系を含む。酵母プロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グルコキナーゼ、およびグリセルアルデヒドレート−３−ホスホネートデヒドロゲナーゼを含むが、これらに限定されない。]
[0189] エンハンサーもまた、転写を増強するためにプロモーターに作用するように使用されてもよい。本明細書における使用に適したエンハンサーは、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（cytomeglovirus）初期プロモーターエンハンサー、グロビン、アルブミン、インスリン、およびその他同種のものを含む。]
[0190] 構築物、プロモーター、エンハンサー、および宿主細胞の全般的な議論については、Principles of Gene Manipulation and Genomics; Primrose, Sら、Blackwell Publishing ２００６年、第７版およびFrom Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology、Dale, Jら、Wiley-Interscience、２００７年、第２版を参照されたい。]
[0191] 遺伝子構築物およびベクターを生産するおよび使用するための方法は、当技術分野において周知であり、一般的に、Sambrookら（前掲）およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing、１９８７年において記載される。選択された宿主細胞をベクターを用いて形質転換するための方法、たとえば、Cohen, SN; PNAS ６９巻、２１１０頁、１９７２年によって記載される塩化カルシウム処理もまた公知である。]
[0192] 記載される遺伝子構築物およびベクターを含む宿主細胞は、原核生物または真核生物、たとえば酵母、細菌、菌類、昆虫（たとえばバキュロウイルス）、動物、哺乳動物、または植物の生物体の源に由来してもよい。一実施形態において、宿主細胞は、単離宿主細胞である。宿主細胞として最も一般的に使用される原核生物は、E. coliの株である。他の原核生物宿主は、Pseudomonas、Bacillus、Serratia、Klebsiella、Streptomyces、Listeria、Saccharomyces、SalmonellaおよびMycobacteriaを含むが、これらに限定されない。]
[0193] 組換えタンパク質の発現のための真核細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、２９３、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびＣＯＳ細胞ならびにＰｒＥＣ、ＬＮＣａＰ、Ｄｕ １４５、およびＲＷＰＥ−２などの前立腺癌細胞系を含むが、これらに限定されない。細胞は、ＡＴＣＣ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡから入手可能である。]
[0194] 本発明の核酸分子の発現と適合性の原核生物プロモーターは、公知技術の構成的プロモーター（バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーターおよびｐＢＲ３２２のベータ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーターなど）ならびに調節可能プロモーター（ｌａｃＺ、ｒｅｃＡ、およびｇａｌなど）を含む。コード配列の上流のリボソーム結合部位もまた、発現に必要とされ得る。]
[0195] 発現構築物などの遺伝子構築物を含む宿主細胞は、ポリペプチドの組換え生産のための方法において有用である。そのような方法は、当技術分野において周知である（たとえばSambrookら前掲を参照されたい）。方法は、一般的に、本発明のポリペプチドの発現および選択に適したまたは本発明のポリペプチドの発現および選択を促す条件の適切な培地における宿主細胞の培養を含む。選択可能マーカーを有する細胞は、本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞の選択に適切な培地上でさらに成長させてもよい。本発明のポリペプチドを発現する形質転換宿主細胞は、ポリペプチドの発現に適した条件下で選択され、培養される。発現組換えポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、およびその他同種のものを含む、当技術分野において周知の方法を使用して、培地から分離され、精製されてもよい（たとえばDeutscher編、１９９０年、Methodsin Enzymology、１８２巻、Guide to Protein Purification）。宿主細胞はまた、本発明の発現ポリペプチドによって生成される産物の生産のための方法において有用である可能性がある。]
[0196] 他の態様において、本発明は、対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、
対象から採取されたかまたは対象に由来する生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰのレベルを、コントロール、対照標準値または対照標準の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準レベルよりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法を提供する。]
[0197] 他の態様において、本発明は、対象における、急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答をモニターするための方法であって、対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロール、対照標準、または対照標準の範囲からのＧＲＮ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準レベルからのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルにおける変化は、治療に対する応答を示す方法を提供する。]
[0198] ｐｒｏＢＮＰ２７〜１０２、ｐｒｏＢＮＰ２７〜４７などのＢＮＰ前駆体は、心臓移植拒絶エピソードを予測するまたは診断するのに使用することができかつ呼吸困難（息切れ）に対する肺起因と心血管起因とを区別するために使用することができることは、当技術分野において公知である。ＵＳ２００５／０２４４９０２を参照されたい。ＧＲＮ−ＳＰは、心組織分析に基づく心臓移植拒絶エピソードの早期マーカーとして使用することができかつ急性心障害と肺障害を区別するために使用することができることが企図される。]
[0199] したがって、本発明はまた、対象における心臓移植拒絶エピソードを予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、心臓移植後の対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを、コントロール、対照標準、または対照標準の範囲からのＧＲＮ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準よりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、移植拒絶を示す方法をも提供する。]
[0200] 本発明はまた、対象における肺障害と急性心障害（ＡＣＤ）とを区別するための方法であって、対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程および上述のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルをコントロールもしくは対照標準または対照標準の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルまたは対照標準レベルよりも高いＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法をも提供する。]
[0201] 一実施形態において、本発明はまた、対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の最初の約２時間以内に、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の約２時間以内に、対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを測定する工程を含む方法を提供する。]
[0202] ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの測定レベルは、コントロール、対照標準、または対照標準の範囲からのＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルと比較され、コントロールレベルまたは対照標準レベルよりも高いＧＲＮ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは移植拒絶を示す。]
[0203] 熟練している読者は、評価目的のために、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルが、一般的に、対照標準値もしくは対照標準の範囲またはコントロール値と相互に関連するということを十分に理解するであろう。]
[0204] 本明細書において使用されるように、コントロールは、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー試料が採取され、平均ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルが決定される個人またはグループとすることができる。通常、個人またはグループは、正常な健康な個人またはグルコース処理障害、糖尿病、ＡＣＤ（心臓移植拒絶を含む）、またはＡＣＤ／肺障害などの、モニターされることとなる生物学的事象に罹患していることが知られていない個人のグループを含む。ほとんどの個人におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルは、３５〜５０ｐｍｏｌ／Ｌの間にあり、平均コントロールレベルは、約４３ｐｍｏｌ／Ｌである。その代わりに、コントロールレベルは、以前に試験された個人またはグループからの複数の読み取り値に基づいて評価されてもよい。]
[0205] コントロールレベルの他の例は、グルコース処理障害を有する糖尿病患者、または肥満症個人または個人からの心組織または組織における、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルおよびグレリンレベルの間のレシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）測定値である。対象の（１つまたは複数の）ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルは、そのコントロール集団についての平均ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルと比較することができる。心組織のコントロール集団におけるＧＲＮ−ＳＰレベルは、正常なコントロール集団におけるＧＲＮ−ＳＰレベルよりも、ほぼ、約１．５〜５倍、一般的に約２〜３倍、もしくは約２．５〜３倍（またはそれを超えて）高くなり得る。糖尿病患者またはグルコース処理障害コントロール集団におけるＧＲＮ−ＳＰレベルは、正常なコントロール集団におけるＧＲＮ−ＳＰレベルよりも、ほぼ、約２〜４倍高くてもよいしあるいは低くてもよい３１。
その代わりに、コントロールは、より早期の時間に、同じ対象から採取される１つまたは複数の読み取り値またはそのような読み取り値の平均値であってもよい。特定の方法に対して適切なコントロールおよびコントロールレベルを確認することは、当技術分野において周知である。]
[0206] 試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルを測定するための工程は、試験される生物学的事象に依存して、１つの試料に対する１回の測定またはいくつかの試料に対する繰り返しの測定としてもよいことが十分に理解されるであろう。ＡＣＤの場合には、測定は、たとえば、異なる時間において対象から採取されたかまたは対象に由来する試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーの１〜２０回の測定、１〜１０回、１〜５回、１〜３回、１もしくは２回、または２もしくは３回の測定を含んでいてもよい。一実施形態において、測定は、障害の発症の最初の約６、５、４、３、２時間以内に、または１時間以内になされてもよいしまたは障害の臨床提示の最初の約６、５、４、３、２時間以内に、または１時間以内に試料においてなされてもよい。上記の試料期間外の１回のまたは繰り返しの測定もまた、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルが、正常なコントロールレベルまたは心組織コントロールレベルまたは関連する対照標準レベルもしくは対照標準の範囲と比較して上昇したかまたは低下したかどうかを確証するためになされてもよい。]
[0207] 一実施形態において、方法は、発症または提示の約１時間内に採取された１つまたは２つの試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルを測定する工程、その後の、発症もしくは提示またはＧＲＮ−ＳＰレベルの最初の測定の約２〜約４時間以内または約２〜約３時間以内に採取された１つまたは２つの試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルを測定する工程を含む。]
[0208] 上記に述べられるように、ＧＲＮ−ＳＰレベルは、発症または提示の最初の６、４、または２時間以内に測定され、正常なコントロールにおいて測定されるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーレベルよりも１．５〜５倍高くなり得、通常は２〜３倍高い。]
[0209] 他の実施形態において、試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルが、約６５〜約２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、約６５〜約２００ｐｍｏｌ／Ｌ、約７０〜約１５０、または約７０〜約１３０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にある場合は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶を示す、またはＡＣＤを肺障害から区別する。]
[0210] たとえば糖尿病またはグルコース処理障害などの生物学的事象もしくは障害の場合には、測定は、定期的にインスリンに対して使用されるなどの、確証された臨床的評価と関連した複数の計算を含んでいてもよい。]
[0211] 上記に規定される生物学的試料は、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーがそこに存在し得るかまたは分泌され得る任意の生物学的物質とすることができる。一実施形態において、生物学的試料は、循環性生物学的試料、たとえば血液、血清、または血漿である。一実施形態において、生物学的試料は、心組織である。]
[0212] 核酸アッセイ
試料におけるＧＲＮ−ＳＰの存在およびその発現レベルは、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＦＩＳＨ、もしくはｍＲＮＡの転写を定量するための定量的ＰＣＲ［（Thomas、Proc. Nat, Acad. Sci. USA ７７巻：５２０１〜５２０５頁 １９８０年）、（Jain KK、Med Device Technol. ２００４年５月；１５巻（４号）：１４〜７頁）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、または本明細書において提供される配列に基づいて、適切に標識されたプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーションなどの、当技術分野において公知の方法に従って決定されてもよい。]
[0213] したがって、本発明はまた、試料における、本発明の核酸分子の存在の検出のためのアッセイであって、該方法は、
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと試料を接触させる工程および
（ｂ）試料におけるハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含むアッセイをも提供する。]
[0214] 一実施形態において、核酸分子は、配列番号１８またはその変異体もしくは断片である。]
[0215] 一実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、標識プローブである。標識の例は、蛍光標識、化学発光標識、放射性酵素標識、およびビオチン−アビジン標識を含む。標識プローブの標識および可視化は、上記のものなどの公知の技術の方法に従って実行される。]
[0216] 便宜上、核酸プローブは、樹脂（ポリアクリルアミドなど）、炭水化物（セファロースなど）、プラスチック（ポリカーボネートなど）、およびラテックスビーズを含むが、これらに限定されない固体支持体上に固定されてもよい。]
[0217] 上記に論じられるように、核酸分子プローブは、好ましくは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡ分子であってもよい。一実施形態において、プローブは、配列番号１８であるかまたは配列番号１８を含む。]
[0218] ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記に論じられるとおりである。]
[0219] 核酸マーカーの発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む電気泳動技術などの、公知技術の技法を使用して決定されてもよい。これらの技法を使用して、本発明の核酸分子のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列は、対象試料において増幅され、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはＲＮＡのレベルが測定される。]
[0220] 代替方法において、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡのレベルは、増幅を伴わないで試料において直接測定されてもよい。]
[0221] 一実施形態において、方法は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析である。ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析における使用のためのプローブは、本明細書において同定されるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカー配列に基づいて調製されてもよい。一実施形態において、プローブは、対照標準配列の少なくとも１０、少なくとも１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３６、４２、５１、６０、６３、６６、もしくは６９またはそれを超える隣接するヌクレオチドを含む。]
[0222] その代わりに、発現レベルは、核酸配列に特異的なプライマーを使用して、逆転写ベースのＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを使用して測定されてもよい。望ましい場合、試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーポリヌクレオチドのレベルの比較は、コントロール核酸分子に関してなすことができ、この発現は、測定されているパラメーターまたは条件に非依存性である。コントロール核酸分子は、レベルが障害または移植拒絶状態と健康な状態との間で異ならない分子を指す。コントロール分子のレベルは、比較集団におけるレベルを標準化するために使用することができる。そのようなコントロール分子の例は、ＧＡＰ−ＤＨである。本発明のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーポリヌクレオチドは、生物学的事象または障害で、レベルを変化させる。]
[0223] ペプチドアッセイ
一実施形態において、測定工程は、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーと、ＧＲＮ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する（選択的にまたは特異的に結合することを含む）結合剤との間の結合を検出する工程を含む。測定におけるプレ工程として、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーポリペプチドは、ＧＲＮ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する結合剤と結合されてもよい。]
[0224] したがって、一実施形態において、本発明は、生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、試料におけるＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイを提供する。]
[0225] 一実施形態において、生物学的試料は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の発症から６時間以内にもしくは４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の６時間以内にもしくは４時間以内に、対象から得られる。]
[0226] 一実施形態において、本発明は、ＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーについてのアッセイであって、
（ａ）生物学的試料からの１つまたは複数のＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーポリペプチドを結合させる工程および
（ｂ）結合したＧＲＮ−ＳＰバイオマーカーポリペプチドのレベルを測定する工程を含むアッセイを提供する。]

权利要求:

請求項1
グレリンシグナルペプチド（ＧＲＮ−ＳＰ）結合剤。
請求項2
（ａ）ＧＲＮ−ＳＰ（１〜２３）配列番号１５、（ｂ）ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）配列番号１７、（ｃ）配列番号１６、または配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの変異体もしくは断片に結合する請求項１に記載のＧＲＮ−ＳＰ結合剤。
請求項3
抗ＧＲＮ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片である、請求項１または請求項２に記載のＧＲＮ−ＳＰ結合剤。
請求項4
ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）（配列番号１７）に選択的に結合する、請求項２または請求項３に記載の結合剤。
請求項5
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片である、請求項３または請求項４に記載の結合剤。
請求項6
検出可能なマーカーを用いて標識される、請求項１から５のいずれか一項に記載の結合剤。
請求項7
ＧＲＮ−ＳＰ断片をコードする単離核酸分子であって、前記核酸は、（ａ）配列番号１８またはその変異体もしくは断片、（ｂ）配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、（ｃ）配列番号１８またはその変異体もしくは断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの相補体から、前記配列が配列番号１６ではないということを条件として、選択される単離核酸分子。
請求項8
ベクター、発現構築物、または宿主細胞を含む、請求項７に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
請求項9
（ａ）ＧＲＮ−ＳＰ（１〜９）（配列番号１７）またはその変異体もしくは断片、（ｂ）配列番号１７のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および（ｃ）請求項７に記載の核酸分子によってコードされるＧＲＮ−ＳＰポリペプチドから選択される単離ＧＲＮ−ＳＰポリペプチド。
請求項10
抗ＧＲＮ−ＳＰ抗体の調製における、請求項９に記載のポリペプチドの使用。
請求項11
対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、前記試料におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイ。
請求項12
ＧＲＮ−ＳＰのレベルは、ＧＲＮ−ＳＰに結合するまたは選択的に結合する結合剤へのＧＲＮ−ＳＰの結合を通して前記試料において検出される、請求項１１に記載のアッセイ。
請求項13
（ａ）生物学的試料からの１つまたは複数のＧＲＮ−ＳＰを結合させる工程および（ｂ）結合したＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、ＧＲＮ−ＳＰについてのアッセイ。
請求項14
ＧＲＮ−ＳＰは、請求項１から６のいずれか一項に記載のＧＲＮ−ＳＰ結合剤を使用して結合する、請求項１２または１３に記載のアッセイ。
請求項15
前記生物学的試料は、循環性の源からの試料である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のアッセイ。
請求項16
ＧＲＮ−ＳＰのレベルは、ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、もしくはＦＴＩＣＲによるものを含めた質量分析を使用して、またはＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のアッセイ。
請求項17
前記測定は、基質に結合した抗ＧＲＮ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片を含むＳＥＬＤＩプローブを提供する工程、前記抗体または断片が前記試料からの１つまたは複数のＧＲＮ−ＳＰを捕捉するように、前記抗体または断片を前記生物学的試料と接触させる工程、およびＳＥＬＤＩを使用して、結合したＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、請求項１６に記載のアッセイ。
請求項18
対象における生物学的事象または障害を予測する、診断する、またはモニターするのに使用されるＧＲＮ−ＳＰアッセイ。
請求項19
対象における生物学的事象または障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、前記事象または障害は、血行路への、ＧＲＮ−ＳＰの放出と相互に関連し、（ａ）前記対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程および（ｂ）前記ＧＲＮ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルからの、前記測定レベルにおける偏差は、生物学的事象または障害を示す方法。
請求項20
対象における糖尿病または糖尿病の可能性を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、（ａ）前記対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程および（ｂ）前記ＧＲＮ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも低いＧＲＮ−ＳＰの測定レベルは、糖尿病または糖尿病に対する素因を示す方法。
請求項21
対象におけるグルコース処理を評価するための方法であって、（ａ）グルコースの投与の後に、対象におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程および（ｂ）前記ＧＲＮ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰと比較する工程を含み、前記コントロールレベルからの、前記ＧＲＮ−ＳＰの測定レベルにおける偏差は、グルコース処理障害を示す方法。
請求項22
対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、（ａ）前記対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程および（ｂ）前記ＧＲＮ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＧＲＮ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高いＧＲＮ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法。
請求項23
前記方法は、対象における、急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答を評価するまたはモニターするために使用され、前記コントロールレベルからの前記ＧＲＮ−ＳＰの測定レベルにおける変化は、前記治療に対する応答を示す、請求項２２に記載の方法。
請求項24
ＡＣＤの発症の最初の６時間、４時間、または２時間以内に、またはＡＣＤの臨床提示の最初の６時間、４時間、または２時間以内に、前記対象からの生物学的試料におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
請求項25
ＧＲＮ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤの発症の最初の６時間、４時間、２時間、１時間、または３０分以内に測定されるか、またはＡＣＤの臨床提示の最初の６時間、４時間、２時間、１時間、または３０分以内に測定される、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
請求項26
６５〜２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、６５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌ、７０〜１５０または７０〜１３０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の、前記試料におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤを示す、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
請求項27
前記コントロールレベルよりも１．５〜５倍、または２〜３倍高い、前記試料におけるＧＲＮ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤを示す、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
請求項28
前記急性心障害は、提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴う急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、不安定狭心症、急性非ＳＴ上昇心筋梗塞；心虚血、急性心外傷、急性薬物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、または心性の移植拒絶エピソードである、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
請求項29
前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、唾液、間質液、尿、または心臓組織試料である、請求項２０から２８のいずれか一項に記載の方法。
請求項30
前記測定工程は、（ａ）ＧＲＮ−ＳＰを結合剤と結合させる工程および（ｂ）結合したＧＲＮ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、請求項２０から２９のいずれか一項に記載の方法。
請求項31
前記結合剤は、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合剤である、請求項２０から３０のいずれか一項に記載の方法。
請求項32
ＧＲＮ−ＳＰのレベルは、質量分析（ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、またはＦＴＩＣを含む）、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、請求項２０から３１のいずれか一項に記載の方法。
請求項33
前記ＡＣＤの１つまたは複数の非ＧＲＮ−ＳＰマーカーのレベルを測定する工程および前記レベルを、コントロールからのマーカーレベルと比較する工程をさらに含み、前記コントロールレベルからの前記測定レベルにおける偏差は、ＧＲＮ−ＳＰの前記コントロールレベルよりも高いＧＲＮ−ＳＰの測定レベルと共に、前記ＡＣＤを予測するもしくは診断するのに役立つかまたは前記ＡＣＤをモニターするために使用することができる、請求項２２から３２のいずれか一項に記載の方法。
請求項34
前記非ＧＲＮ−ＳＰマーカーは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ミオグロビン、ＡＮＰ、ＡＮＰ−ＳＰ、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｈ−ＦＡＢＰ、虚血修飾アルブミン、エンドセリン、アドレノメデュリン、レニン、およびアンギオテンシンＩＩから成る群から選択される、請求項３３に記載の方法。
請求項35
糖尿病の１つまたは複数の非ＧＲＮ−ＳＰマーカーのレベルを測定する工程および前記レベルを、コントロールからのマーカーレベルと比較する工程をさらに含み、非ＧＲＮ−ＳＰマーカーの前記コントロールレベルからの前記測定レベルにおける偏差は、ＧＲＮ−ＳＰの前記コントロールレベルよりも低いＧＲＮ−ＳＰの測定レベルと共に、糖尿病を予測するもしくは診断するのに役立つかまたは糖尿病をモニターするために使用することができる、請求項２０および請求項２０に従属する場合の請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
請求項36
前記非ＧＲＮ−ＳＰマーカーは、グルコース、インスリン、ラクテート、トリグリセリド（trigycleride）、および脂肪酸またはそれについてのマーカーから成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
請求項37
対象における生物学的事象または障害を評価するためのＧＲＮ−ＳＰアッセイの製造のための、ＧＲＮ−ＳＰ結合剤の用途。
請求項38
対象における生物学的事象または障害の評価についての予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、ＧＲＮ−ＳＰ結合剤の用途。
請求項39
前記生物学的事象または障害は、糖尿病または糖尿病の可能性である、請求項３７または３８に記載の用途。
請求項40
前記生物学的事象または障害は、グルコース処理障害である、請求項３７または３８に記載の用途。
請求項41
前記生物学的事象または障害は、ＡＣＤである、請求項３７または３８に記載の用途。
請求項42
前記結合剤は、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合剤である、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の用途。
請求項43
前記評価、予測、診断、またはモニターは、請求項１１から１８のいずれか一項に記載のアッセイまたは請求項１９から３６のいずれか一項に記載の方法を使用して達成される、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の用途。
請求項44
生物学的事象または障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、ＧＲＮ−ＳＰ結合剤および任意選択で、対象からの生物学的試料において測定されるＧＲＮ−ＳＰレベルから、前記対象における生物学的事象または障害を予測する、診断する、またはモニターするための説明書を含むキット。
請求項45
急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、ＧＲＮ−ＳＰ結合剤および任意選択で、ＡＣＤの発症またはＡＣＤの臨床提示の６時間以内または４時間以内に得られる生物学的試料において測定されるＧＲＮ−ＳＰレベルから、発症または臨床提示の６時間以内または４時間以内に、対象におけるＡＣＤを予測する、診断する、またはモニターするための説明書を含むキット。
請求項46
前記ＧＲＮ−ＳＰ結合剤は、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合剤である、請求項４４または４６に記載のキット。
請求項47
前記キットは、０．１〜３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌ、または１０〜２５０、または２０〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＧＲＮ−ＳＰレベルを測定するために較正される、請求項４４から４６のいずれか一項に記載のキット。